乙醇对小鼠认知能力的影响及其与海马M1受体的关系

邹丹，吴敏范，金戈，郑燕，陈凤梅

（沈阳医学院1.病理生理教研室；2.生理教研室；3.药理教研室；4.2012级临床医学，沈阳 110034）

·论著·

乙醇对小鼠认知能力的影响及其与海马M1受体的关系

邹丹1，吴敏范2，金戈3，郑燕4，陈凤梅4

（沈阳医学院1.病理生理教研室；2.生理教研室；3.药理教研室；4.2012级临床医学，沈阳 110034）

目的研究乙醇对小鼠认知能力的影响及其与小鼠海马结构M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M1受体）含量变化的关系，进一步揭示乙醇引起脑损伤的机制。方法将60只雌性小鼠随机分为对照组、8%、16%、32%乙醇给药组，以0.2 mL/10 g给药8周后，Morris水迷宫检测小鼠学习记忆能力，ELISA法检测各组小鼠海马结构中M1受体含量的差异。结果与各自第1天比较，各实验组小鼠第5天逃避潜伏期均值均明显缩短。各乙醇组小鼠第5天逃避潜伏期均值与对照组第5天均值比较，无统计学差异。16%、32%乙醇组小鼠在靶象限活动时间明显短于对照组。各乙醇组小鼠海马结构内M1受体含量与对照组比较明显下降，且与乙醇摄入量呈剂量依赖关系。结论海马结构M1受体含量降低是乙醇引起小鼠记忆能力下降的原因之一。

乙醇中毒；海马结构；M1受体；认知

乙醇是亲脂性小分子化合物，能迅速通过血脑屏障作用于脑组织，与神经细胞膜有较高的亲和力，并通过作用于膜上的某些酶类和受体而影响细胞的功能，进而引起学习、记忆、认知、判断等一系列神经行为功能的改变。研究表明，乙醇中毒已成为诱导痴呆发病的重要因素［1］。海马结构作为大脑边缘系统的重要组成部分，与学习、记忆及感觉信息加工密切相关。急性乙醇摄入可以通过影响海马的θ节律及海马锥体细胞神经元活性等对海马的生理功能造成影响［2］。急性乙醇中毒主要损害空间记忆能力，且海马结构CA1区Fos表达明显减少［3］，进一步提示乙醇对神经系统的作用与其对海马结构的特异性影响有密切关系。胆碱能神经元是中枢神经系统重要的神经元，M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体（M1 muscarinic acetylcholine receptors，M1受体）主要分布于大脑皮质、海马结构、纹状体等神经组织，定位于突触后膜，接受突触前末梢释放的乙酰胆碱的刺激，海马结构内的M1受体直接参与空间学习记忆过程［4］。乙醇引起小鼠学习记忆能力下降可能是通过影响海马中M1受体的表达水平来介导的。

本研究拟采用Morris水迷宫对小鼠慢性乙醇摄入引起的认知功能损伤进行评价，旨在找到乙醇对小鼠认知影响的量效规律，并通过ELISA法测定小鼠海马结构M1受体的含量，探讨乙醇对海马损伤的分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雌性昆明种小鼠60只，6周龄，体质量（23±3）g，购自辽宁长生生物技术有限公司，自由摄食、饮水。

1.1.2 试剂：乙醇（分析纯，≥99.7%，北京化工厂），根据浓度要求每天灌胃给药前临时配制；小鼠M1受体ELISA试剂盒（美国Bluegene公司，批号：E03A0107）。

1.1.3 仪器：（1）Morris水迷宫（成都泰盟科技有限公司）：水池直径100 cm，高50 cm。平台直径8 cm，高24 cm。水池上方通过摄像头与计算机相连，记录小鼠游泳轨迹，通过分析软件获得小鼠全程游泳轨迹、找到平台所需的时间（潜伏期）、总的游泳路程，以及每一象限（水迷宫分为4个象限）的游泳时间等实验数据。水迷宫测试时的环境应保证黑暗和安静，使小鼠的行为不受外界干扰。小鼠开始训练后，周围物体位置需固定。（2）其他：Biofuge 28RS低温高速离心机（德国Heraeus Sepatech公司）；ELx800酶标仪（美国BioTek公司）；Heros-Mole TL2020高通量组织研磨仪（北京鼎号源科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及动物处理：经1周适应期饲养，将小鼠随机分成4组（对照组及低、中、高剂量乙醇组），每组15只。低、中、高剂量乙醇组灌胃给药剂量分别为乙醇体积分数8%、16%、32%（即3个剂量乙醇组的给药量分别为：1.28、2.56、5.12 g/kg），正常对照组为等量蒸馏水。每天于早8点对小鼠进行灌胃给药，连续8周。

1.2.2 Morris水迷宫记忆功能测定：（1）定位航行实验（反映空间记忆的获得能力）：于实验第57天，停止给药。对40只小鼠进行水迷宫训练5 d，每天训练2次（上午10点，下午14点），每次60 s。将小鼠面朝池壁放入水中，同时启动记录装置，通过该系统的图像分析软件可获得小鼠在水中的逃避潜伏期。小鼠找到并爬上平台后，让其停留5 s，若小鼠入水后60 s内未能找到并爬上平台，则将其引导至平台上停留10 s，此时逃避潜伏期记录为60 s。每次训练完成后，迅速将小鼠擦干，防止低体温。每天各小鼠逃避潜伏期用2次训练的均值表示。（2）空间搜索实验（检测空间记忆的保持能力）：实验第62天撤去平台，每只小鼠从固定象限中点面朝池壁放入水中，记录小鼠60 s池内活动情况，通过该系统的图像分析软件获得60 s内小鼠经过原平台所在靶象限的时间。

1.2.3 实验取材：完成空间搜索实验后立即断头处死小鼠，冰上分离双侧海马，置于-80℃保存，以备检测各组海马结构M1受体水平。

1.2.4 酶联免疫法测定海马中M1受体含量：先用预冷的PBS（0.02 mol/L，pH7.0～7.2）清洗组织后称质量，5 mg组织加入40 μL预冷PBS（0.02 mol/L，pH7.0～7.2）。用高通量组织研磨仪裂解细胞，5 000 r/min离心15 min后取上清。按照ELISA试剂盒说明书操作，分别将标准品及样品各100 μL加入微孔中，空白对照加入100 μL PBS（pH7.0～7.2）。取10 μL平衡液加入100 μL样品中。在各孔中加入50 μL的酶标记溶液（不含空白对照组）。37℃孵育反应1 h。充分清洗酶标板5次，酶标板洗涤后用吸水纸彻底拍干。各孔加入显色剂A、B各50 μL。37℃避光反应15 min。终止反应后使用酶标仪（490 nm波长）依序测定各样品中M1受体的含量。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 小鼠一般状态

对照组小鼠皮毛光滑，身体健壮，饮食、活动、体质量增长正常；各乙醇组小鼠皮毛暗淡不整，精神不振，对外界刺激反应迟钝，身体消瘦，进食等活动减少，死亡7只。各组剩余小鼠中随机保留10只，进行水迷宫测试。

2.2 Morris水迷宫结果

2.2.1 不同浓度乙醇对小鼠学习能力的影响：各组小鼠的平均逃避潜伏期如图1所示：经过5 d的Morris水迷宫定位航行实验，各组小鼠第5天逃避潜伏期均值均较第1天明显缩短，对照组和8%、16%、32%乙醇组第5天逃避潜伏期均值分别为（34.47± 9.46）s，（29.65±14.15）s，（35.71±12.57）s，（37.03± 11.81）s；第1天逃避潜伏期均值分别为（54.29± 11.75）s，（52.97±8.10）s，（53.73±9.35）s，（58.20± 3.18）s，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明随着定位航行训练次数的增加，各组小鼠都具有了一定的空间学习能力。

图1 各组小鼠第1天和第5天定位航行测试平均逃避潜伏期比较Fig.1 The escape latency of place navigation test is compared between the first day and fifth day in each group

2.2.2 不同浓度乙醇对小鼠记忆能力的影响：小鼠完成5 d的Morris水迷宫定位航行实验后，于第6天进行空间探索测试，图2所示为各组小鼠在原平台所在靶象限活动时间。与对照组［（21.20±5.11）s，n=10］比较，8%乙醇组［（22.61±4.88）s，n=10］在靶象限的活动时间稍有延长，但差异无统计学意义。16%乙醇组［（16.21±5.21）s，n=10］与32%乙醇组［（14.75±4.79）s，n=10］在靶象限的活动时间明显短于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01），表明16%与32%乙醇对小鼠的记忆能力有一定的损伤作用。

图2 各组小鼠第6天空间探索测试靶象限活动时间比较Fig.2 The active time in the target quadrant in spatial probe test is compared among each group on the sixth day

2.3 不同浓度乙醇对小鼠海马结构M1受体的影响

如图3所示：小鼠经过56 d的乙醇灌胃及后续6 d的水迷宫实验测试后，8%、16%、32%乙醇组小鼠海马结构M1受体浓度分别为（1 244.81±324.56）、（1 009.95±309.47）、（977.46±340.32）pg/mL，均低于对照组［（1 525.19±303.61）pg/mL］（P＜0.01）。表明8%、16%、32%的乙醇均可造成小鼠海马结构M1受体含量下降。

图3 各组小鼠海马结构M1受体浓度比较Fig.3 Concentration of M1 receptor is compared among distinct groups

3 讨论

学习是通过神经系统不断接受外界环境的刺激而获得新知识、新行为的过程，即获得信息的过程。学习与记忆密切相关，大脑储存、提取和再现获得的信息就是记忆。海马是大脑边缘结构的重要组成部分，不仅与学习记忆有关，还参与注意、感知觉信息处理、情绪和运动等多种生理、心理过程。研究表明，产前酒精暴露的青年人记忆力的欠缺与包括海马在内的脑容量降低密切相关［5］。海马组织与大脑皮质及皮质下中枢形成广泛纤维连接，尤其是胆碱能神经纤维，构成了三维结构，即信息回路。该回路可将短时记忆转为长时记忆，并在空间、航行定位功能中起重要的作用［6］。海马组织中富含乙酰胆碱等神经递质［7］，参与学习记忆过程。

本研究中，小鼠水迷宫定位航行测试结果显示：对照组及各给药组第5天逃避潜伏期均值都比各自组别的第1天潜伏期均值明显缩短。尽管高、中剂量乙醇组第5天逃避潜伏期均值较对照组第5天有升高趋势，但并无统计学差异。而低剂量乙醇组第5天逃避潜伏期均值较对照组第5天有降低趋势，亦无统计学差异。提示经8周高、中、低剂量乙醇灌胃给药处理后，各组小鼠学习能力差异不明显。最近的研究表明，小鼠慢性乙醇暴露后急性停用乙醇，虽削弱了情境学习能力，但提高了线索学习能力［8］。水迷宫空间探索测试的结果显示：与对照组相比，8%乙醇组小鼠在靶象限的活动时间稍有延长，但无统计学差异。16%与32%乙醇组小鼠在靶象限的活动时间明显短于对照组（P＜0.05，P＜0.01）。表明小鼠经8周高、中剂量乙醇灌胃给药处理，空间记忆功能有明显的损伤。提示乙醇对空间学习能力和空间记忆能力的影响可能存在差异。

研究表明，M1受体有利于哺乳动物的探查行为，也是乙酰胆碱对锥体细胞兴奋性发挥最直接作用的必要条件［9］。M1受体是参与兴奋性海马环路的胆碱能直接调节的主要M受体亚型［10］。大鼠海马神经元细胞表面M1受体激活可引发磷脂酰肌醇水解以及θ节律的网络振荡，瞬时提高长时程增强（long-term potentiation，LTP），而细胞内的M1受体激活可使细胞外的调节激酶磷酸化，逐渐提高LTP［11］。本研究结果发现，小鼠经过8周乙醇灌胃处理后，高、中、低3个剂量组海马结构M1受体的浓度较对照组均降低；乙醇高、中剂量组小鼠空间探索测试实验中靶象限活动时间较对照组明显缩短，差异有统计学意义，提示高、中剂量乙醇对小鼠记忆功能的损伤可能与M1受体浓度降低有关。低剂量乙醇组小鼠记忆功能没有明显减退，而M1受体仍然降低，表明脑内除M1受体外，还有其他机制参与复杂的学习记忆过程，有待进一步研究。

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（编辑 王又冬）

Correlation Study ofCognitive Disorder Induced by Ethanoland M1 Receptor in Hippocampusin Mice

ZOUDan1，WUMin-fan2，JINGe3，ZHENGYan4，CHENFeng-mei4
（1.DepartmentofPathophysiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；2.DepartmentofPhysiology，Shenyang MedicalCollege，Shenyang 110034，China；3.Department of Pharmacology，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China；4.Grade 2012 Clinical Medicine，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，China）

ObjectiveTo investigate the effectofethanolon levelofthe main hippocampalsubtype ofmuscarinic receptor（M1）in mice，and evaluate whetherthe contentchange on thisreceptorcould be linked with alterations in cognition，so as to furtherrevealthe mechanism ofbrain damage induced by ethanol.MethodsSixty female mice were randomly divided into four groups.The model mice were induced by intragastric administration of ethanol at dose of 8%，16%，and 32%respectively of 0.2 mL/10 g for 8 weeks according to the protocol，and control group were treated with intragastric administration of distilled water.The capability of learning and memory were examined by Morris water maze，and ELISA method was used to measure the M1 receptor content in hippocampus in each group of mice.ResultsCompared with first day，the mean escape latency period on the fifth day was significantly shortened in each group.There was no significant difference between ethanol and control group for the mean escape latency period on the fifth day.Compared with the control group，the active time in the target quadrant was significantly shortened in 16%and 32%ethanol group.M1 receptor content in hippocampus formation was significantly decreased in all the ethanol group mice.The ethanol concentration was negative correlated with the M1 receptor content.ConclusionChronic alcoholism can induce the memory impairment in mice，which might be associated with the low levelofM1 receptorsubtype in hippocampusofmice.

alcoholism；hippocampus formation；M1 receptor；cognition

R338.2

A

0258-4646（2015）07-0602-04

教育部留学归国人员科研启动基金（2013-693）

邹丹（1971-），女，副教授，博士.

E-mail：zoudan1166@hotmail.com

2014-12-24

网络出版时间：