胡桃醌对胶质瘤细胞株U-87 MG迁移、侵袭能力的抑制作用☆

杨丹王丽李珠刘赵阳孙燕郭丽付佳祁荣王俊平

·论 著·

胡桃醌对胶质瘤细胞株U-87 MG迁移、侵袭能力的抑制作用☆

杨丹*王丽*李珠*刘赵阳*孙燕*郭丽**付佳**祁荣**王俊平*

目的探讨肽基脯酰胺顺反异构酶Pin1（peptidyl-prolyl isomerase 1）抑制剂胡桃醌（Juglone）对胶质瘤细胞U-87 MG迁移、侵袭能力的影响并探讨相关机制。方法胶质瘤细胞株U-87 MG经0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌处理后，以细胞划痕实验检测细胞迁移能力，transwell小室实验检测细胞侵袭能力，western blot法检测β-链蛋白（β-catenin）、血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的蛋白表达水平。结果细胞划痕实验结果显示1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌组U-87 MG细胞划痕创面愈合率分别为46.04%±6.25%和30.05%±13.35%，与0 μmol·L-1组比较明显下降（P＜0.05）；transwell小室实验结果显示1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌组穿膜细胞数平均为（103.67±5.69）个和（77.33±7.77）个，与0 μmol·L-1组比较明显减少（P＜0.05）；western blot实验结果显示胡桃醌可显著下调U-87 MG细胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平，作用随浓度增加而增大。结论胡桃醌可通过下调β-catenin及其下游MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表达而抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭能力。

胡桃醌 胶质瘤 β-链蛋白 血管内皮细胞生长因子 基质金属蛋白酶-2基质金属蛋白酶-9

胡桃醌（Juglone）属于萘醌类，分子量174.16，是肽基脯酰胺顺反异构酶Pin1（peptidyl-prolyl isomerase 1）的小分子抑制剂。目前研究表明胡桃醌具有显著的抗肿瘤作用，但研究多为观察其对瘤细胞增殖和凋亡的影响，关于其对肿瘤迁移、侵袭能力影响的报道较少见[1,2]。本研究拟采用细胞划痕实验和Transwell小室法检测其对胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的抑制作用，同时检测胞内β-链蛋白（β-catenin）、血管内皮细胞生长因子（vas⁃cular endothelial growth factor,VEGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）和基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）蛋白含量的变化，从分子水平探讨胡桃醌抑制人胶质瘤细胞迁移、侵袭能力的机制。

1 材料和方法

1.1 研究对象人胶质瘤U-87 MG细胞株由中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库提供，将细胞于37℃，5%CO2培养箱中，用DMEM高糖培养基+10%FBS培养（加入1%L-谷氨酰胺，1%青链霉素），1～2 d更换培养液1次,每2～3 d传代一次，实验时选用对数生长期细胞。试剂与仪器：胡桃醌和溴化四氮唑蓝（MTT）（Sigma公司）；DMEM高糖培养基及胰酶（Gibco公司）；新生牛血清（FBS）（杭州四季青公司）；化学发光检测试剂盒（Pierce公司）；Matrigel（BD公司）；Transwell小室（Costar公司）；VEGF、MM P-2、MMP-9抗体（Santa Cruz公司）；β-catenin抗体（CST公司）；PVDF膜（Millipore公司）。

1.2 MTT比色法检测细胞增殖将U-87 MG细胞接种于96孔板中，细胞浓度为5×104mL-1细胞，体积为100 μL，于37℃，5%CO2条件下培养24 h。加入胡桃醌培养液（终浓度分别为0、15.63、31.25、62.5、125和250 μmol·L-1）体外培养48h后，每孔加入20 μL MTT（终浓度5 g·L-1），37℃继续孵育4 h，弃上清，每孔加入150 μLDMSO振荡10 min，于490 nm测定吸光度值。

1.3 细胞划痕实验将U-87 MG细胞接种于6孔板中，待细胞生长至90%融合后用200 μL吸头在6孔板内垂直划痕，用PBS清洗细胞3次后加入无血清培养基及终浓度0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌继续培养48 h后在倒置显微镜下拍照记录。

1.4 Transwell小室侵袭实验参照文献记述的方法[3]，加入终浓度0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌继续24 h后，每个小室取5个视野计穿膜细胞个数，以穿膜细胞的数目表示肿瘤细胞的侵袭能力。

1.5 蛋白免疫印迹法检测蛋白表达分别以0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1的胡桃醌刺激细胞24 h后，收集细胞总蛋白，SDS-PAGE电泳后转印到NC膜上，用含5%脱脂奶粉的封闭液常温封闭1 h，加入一抗，4℃反应过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗室温下反应0.5 h，化学发光法显影；利用Image J软件对目的条带进行灰度值检测，以actin为内参照分析蛋白相对表达量。

1.6 统计学方法采用SPSS19.0进行统计分析。计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK检验。检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 胡桃醌对U-87 MG细胞增殖抑制作用胡桃醌处理U-87 MG细胞48 h后采用MTT法检测各组吸光度，计算胡桃醌对U-87 MG细胞的增殖抑制率。如图1所示，与0 μmol·L-1组比较，15.63、31.25、62.5、125和250 μmol·L-1胡桃醌组U-87 MG细胞生存率明显降低，细胞增殖抑制率随浓度升高明显增加，分别为7.46%±2.96%、24.95%± 3.33%、39.90%±2.67%、57.44%±1.89%和99.49%±

0.81%，提示当胡桃醌浓度低于15.6μmol·L-1时其对U-87 MG细胞的增殖抑制作用弱，随着胡桃醌浓度增加，其对U-87 MG细胞的增殖抑制作用逐渐增高。胡桃醌作用48 h的IC50值为（78.45± 12.99）μmol·L-1。

2.2 胡桃醌可抑制U-87 MG细胞的迁移能力 选取胡桃醌作用48 h的IC50值的1/25为考察其对U-87 MG细胞的迁移能力影响作用的最大浓度值，此浓度下胡桃醌作用48 h不会对U-87 MG细胞增殖产生影响。划痕实验后分别于0 h和48 h时在倒置光学显微镜下观察并测量划痕伤口的宽度进行统计分析。实验结果如图2和表1所示：划痕后48 h，各组创面愈合率随胡桃醌浓度增加逐渐降低，0 μmol·L-1组为92.91%±1.41%、0.8 μmol· L-1组为87.46%±6.14%、1.6 μmol·L-1组为46.04%± 6.25%、3.2 μmol·L-1组为30.05%±13.35%。 与0 μmol·L-1组相比，1.6μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌组U-87 MG细胞的创面愈合率明显下降（F= 44.53，P＜0.05），表明U-87 MG细胞的迁移能力随着胡桃醌浓度的增高而降低。

2.3 胡桃醌可抑制U-87 MG细胞的侵袭能力采用Transwell小室法检测胡桃醌对U-87 MG细胞侵袭能力的影响，结果如图2和表1所示：加入0、 0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌组中穿过基膜的细胞数分别为（204.67±6.11）个、（192.00±12.17）个、（103.67±5.69）个和（77.33±7.77）个。与0 μmol·L-1组相比1.6 μml·L-1和3.2 μml·L-1胡桃醌组小室滤膜下表面的细胞个数明显减少（F=173.45，P＜0.05），表明U-87 MG细胞的侵袭能力随着胡桃醌浓度的增高而降低。

2.4 胡桃醌抑制U-87 MG细胞中β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9的蛋白表达胡桃醌处理U-87 MG细胞后，western blot法检测细胞内β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白表达的变化。结果如图3和表2所示：给予U-87 MG细胞0、0.8、1.6和3.2 μmol·L-1胡桃醌作用24 h后，与0 μmol·L-1组相比，1.6 μmol·L-1和3.2 μmol·L-1胡桃醌组细胞内β-catenin（F=17.24）、VEGF（F= 33.76）、MMP-2（F=10.907）和MMP-9（F=354.79），的蛋白表达都明显降低（P＜0.05），并且具有浓度依赖性。

表1 胡桃醌对U-87 MG细胞的迁移、侵袭能力的影响

表2 胡桃醌对胶质瘤U-87 MG细胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达的影响（±s，n=5）

表2 胡桃醌对胶质瘤U-87 MG细胞β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白相对表达的影响（±s，n=5）

1)与0μmol·L-1组比较，单因素方差分析，P＜0.05

胡桃醌（μmol·L-1）0 0.8 1.6 3.2 n 5 5 5 5 β-catenin 0.68±0.03 0.61±0.201)0.46±0.281)0.22±0.131)VEGF 0.73±0.42 0.47±0.15 0.44±0.171)0.31±0.091)MMP-2 0.70±0.34 0.56±0.09 0.53±0.061)0.32±0.011)MMP-9 1.79±0.13 1.71±0.07 0.50±0.131)0.28±0.071)

图2 Transwell侵袭实验和划痕实验分别检测各组细胞侵袭能力（×100）和迁移能力（×40）

图3 western blot法检测加入胡桃醌24 h后细胞内β-catenin、VEGF、MMP-2和MMP-9蛋白的表达

3 讨论

胡桃醌存在于胡桃科植物的所有部分，在我国胡桃科植物资源丰富，因此胡桃醌作为抗肿瘤活性单体具有较大的开发潜力[4]。

胶质瘤细胞的迁移和侵袭是胶质瘤复发以及治疗失败的重要原因。Pin1在胶质瘤的过量表达与肿瘤高转移性有着密不可分的联系。胡桃醌是Pin1的小分子抑制剂，本研究通过transwell侵袭实验和划痕实验检测胡桃醌对胶质瘤U-87 MG细胞迁移、侵袭能力的影响，结果显示较低浓度（1.6 μmol·L-1）胡桃醌即可明显抑制胶质瘤细胞迁移、侵袭能力，并且由于此浓度远低于其产生较明显抑制细胞增殖的浓度（15.63 μmol·L-1），证明其对细胞迁移和侵袭能力的抑制率高于生长抑制率，说明大量细胞在死亡之前就已经丧失迁移、侵袭能力，因此胡桃醌在胶质瘤恶性侵袭方面可能发挥有效的治疗作用。

Pin1活性与Wnt信号途径中的关键因子β-catenin功能有关，Pin1可上调细胞中β-catenin蛋白的水平并促进其活性。β-catenin异常表达及活化可以导致肿瘤细胞的迁移、侵袭性增强[5]，故为了进一步探讨胡桃醌抑制胶质瘤迁移、侵袭作用的分子机制，本研究选择β-catenin为研究的切入点。本研究中western blot实验结果显示，胡桃醌能显著降低胶质瘤U-87 MG细胞β-catenin蛋白表达，说明胡桃醌抑制细胞的迁移和侵袭作用可能与其抑制Wnt/β-catenin信号传导通路活性有关。

Wnt/β-catenin信号传导通路可通过激活多种下游分子促进肿瘤细胞迁移、侵袭，如MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白。MMP-2、MMP-9是人体内分布最广泛的基质金属蛋白酶，体外研究显示抑制MMP-2、MMP-9的活性可以阻滞胶质瘤细胞迁移、侵袭[6,7]。VEGF具有通过活化多种蛋白酶降解周围基质而促进肿瘤侵袭转移的作用。已有多项研究表明Wnt/β-catenin信号通路活化可提高MMP-2、MMP-9和VEGF表达[8-9]。为进一步研究

胡桃醌对Wnt/β-catenin信号传导通路活性的抑制作用与其抑制细胞的迁移和侵袭作用相关性，本研究以western blot法检测胡桃醌对Wnt/β-catenin信号传导通路下游与肿瘤细胞侵袭、转移关系密切的MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达水平的影响，研究结果显示胡桃醌能显著降低胶质瘤U-87 MG细胞MMP-2、MMP-9和VEGF蛋白表达水平，提示胡桃醌抑制细胞的迁移和侵袭作用可能与其抑制Wnt/β-catenin信号传导通路活性进而下调其下游MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表达有关。

综上，本研究表明胡桃醌可抑制胶质瘤细胞株U-87 MG迁移、侵袭能力，其作用机制与通过抑制Wnt/β-catenin信号传导通路活性进而下调其下游肿瘤细胞迁移、侵袭相关的重要调节因子MMP-2、MMP-9和VEGF的蛋白表达相关。

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Inhibitory effect of juglone on migration and invasion of glioma cell line U-87 MG.

YANG Dan，WANG Li，LIZhu，LIU Zhaoyang，SUN Yan，GUO Li，FU Jia，QI Rong，WANG Junping.Department of Pharmacology,Shenyang Medi⁃cal College,No.146,North Huanghe Street,Huanggu District,Shenyang 110034,China.Tel：024-62215689.

ObjectiveTo investigate the effects and mechanisms of pin1(peptidyl-prolyl isomerase 1)inhibitor ju⁃glone on migration and invasion in glioma cell line U-87 MG.MethodsGlioma cells were treated with juglone at 0,0.8, 1.6 and 3.2 μmol·L-1.Wound-healing assay and invasion assay were performed to examine the inhibitory activity of ju⁃glone on glioma cell line U-87 MG.Western blot was used to analyze the protein expression of β-catenin,VEGF, MMP-2 and MMP-9.ResultsThe wound-healing assay showed that the wound-healing rate in juglone-treated groups was 46.04%±6.25%and 30.05%±13.35%at concentrations of 1.6 μmol·L-1and 3.2 μmol·L-1,repectively.Juglone treat⁃ment significantly reduced the wound-healing rate compared with controls(P＜0.05).Transwell invasion assay showed that the number of invaded cells in juglone-treated groups was 103.67±5.69 and 77.33±7.77 at the concentrations of 1.6 μmol·L-1and 3.2 μmol·L-1,respectively.Juglone treatment significantly reduced cell invasion compared with con⁃trols(P＜0.05).Treatment with juglone significantly down-regulated the expression levels of β-catenin,VEGF,MMP-2 and MMP-9 in U-87 MG cells in a dose-dependent manner.ConclusionThe present data suggests that juglone has a

Juglone Glioma β-catenin VEGF MMP-2 MMP-9

R979.1

A

2015-01-14）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.04.010

☆ 沈阳市科技计划项目（编号：F10-191-8-00）

* 沈阳医学院药理学教研室（沈阳 110034）

** 沈阳医学院科学实验中心

significant inhibitory action on cell migration and invasion through down-regulation of the β-catenin and its downstream VEGF,MMP-2 and MMP-9 protein expressions in glioma cell line U-87 MG.