低剂量米诺环素对脑缺血再灌注大鼠RGMa表达的影响☆

陶涛秦新月冯金洲

·论 著·

低剂量米诺环素对脑缺血再灌注大鼠RGMa表达的影响☆

陶涛*秦新月*冯金洲*

目的探讨静脉用低剂量米诺环素对大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能恢复及排斥性导向分子（repulsive guidance molecule A,RGMa）表达的影响。方法成年雄性Sprague-Dawley大鼠54只，随机分为假手术组，缺血再灌注组和米诺环素组。采用大脑中动脉线栓法制作局灶性脑缺血再灌注模型。再灌注第2周，分别采用免疫组织化学及Western blot法检测缺血脑组织内RGMa及生长相关蛋白-43（growth associated pro⁃tein-43，GAP-43）蛋白的表达。缺血再灌注第2、7、14和28天，采用改良的神经功能缺损评分（modified neu⁃rological severity score,mNSS）及楼梯实验（staircase test）评估大鼠神经功能。结果同缺血再灌注组相比，低剂量米诺环素使缺血侧大脑皮层RGMa蛋白表达降低（0.53±0.08 vs.1.17±0.15,P＜0.05），GAP-43蛋白表达明显增高（0.94±0.10 vs.0.57±0.09,P＜0.05），大鼠mNSS评分显著下降并改善大鼠的前肢运动功能（P＜0.05）。结论静脉用低剂量米诺环素（3 mg/kg）能促进大鼠缺血再灌注损伤后神经功能的恢复，其机制可能与下调RG⁃Ma蛋白及上调轴突再生相关蛋白GAP-43的表达有关。

米诺环素再灌注损伤大鼠

lated to the down-regulation of RGMa expression and up-regulation of GAP-43 expression.【Key words】Minocycline Reperfusion injury Rats

米诺环素是一种半合成的四环素类抗生素，在临床上被广泛用于抗炎及抗感染治疗。近期大量研究表明米诺环素在多种神经系统疾病的动物模型中具有保护作用[1]。尽管米诺环素发挥神经保护作用的具体分子机制尚不明确，但目前最新的一项临床试验显示米诺环素对人体是安全且可能是有益的[2]，并且是目前最有潜力的神经保护剂之一。本实验采用大鼠大脑中动脉闭塞模型观察米诺环素对大鼠神经功能恢复、排斥性导向因子（repulsive guidance molecule A，RGMa）及生长相关蛋白43（growth associated protein-43，GAP-43）蛋白表达的影响，从而探讨其潜在的神经保护机制。

1 材料与方法

1.1 实验方法

1.1.1 动物分组及给药 54只清洁级雄性SD大鼠，体质量250～280 g，购于重庆医科大学实验动物中心，按随机数字表分为假手术组（S组）、缺血再灌注组（I/R组）和米诺环素干预组（I/R+MC组），每组18只，分别进行免疫印迹、免疫组化及大鼠神经功能评分。干预组在再灌注的同时按1 mL/ l00 g的比例尾静脉注射米诺环素（3 mg/kg，Sigma公司），每日2次，持续14 d。

1.1.2 大鼠脑缺血再灌注模型的制作参照我们课题组前期的实验方法[3]，用线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉阻塞/再灌注模型。术前12 h禁食不禁水。

1.1.3 动物取材术后2周，选取18只大鼠用水合氯醛麻醉，经心脏多聚甲醛灌流固定后，断头取脑，取缺血侧大脑中动脉供血区脑组织（距额叶最前端5 mm到8 mm），石蜡包埋后制作成4 μm厚的冠状切片，用于免疫组化实验。另取18只大鼠，深度麻醉后直接断头取脑，取缺血脑组织，置于冻存管中放入-80℃长期保存，用于Western blot检测。

1.1.4 免疫组化检测蛋白的表达选取4 μm厚的石蜡切片，常规脱蜡至水，微波加热修复表面抗原后参照S-P法试剂盒说明书（北京中杉金桥公司）进行免疫染色。DAB显色阳性结果在光镜下可见棕黄色颗粒。每只动物随机选取10张非连续切片，每张切片在200倍光镜下随机选择5个视野，然后用Image-Pro Plus软件进行分析。

1.1.5 Western blot检测蛋白的表达 将预存脑组织参照膜蛋白提取试剂盒说明书（南京凯基公司）提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。SDS-PAGE电泳后转膜，封闭1 h后加入特异性兔抗RGMa多克隆抗体（Cell Signaling公司）及兔抗GAP-43（武汉博士德公司）4℃孵育过夜，室温孵育二抗2 h，凝胶成像仪中显影拍照，用Quantity One软件分析各条带平均光密度值，以待测蛋白/β-actin光密度的比值表示蛋白表达水平。

1.1.6 行为学评分参照改良神经功能评分（mNSS）[4]及Montoya设计[5]的“楼梯测试”对术后第2、7、14及28天的大鼠进行神经功能、前肢运动功能评价。

1.2 统计学方法采用SPSS 17.0进行统计学分析，实验结果用均（±s）表示，多组间比较运用AVO⁃NA分析，两两比较行LSD检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 米诺环素对脑缺血大鼠神经功能的影响假手术组在各时间点未出现局灶性神经功能缺损症状。缺血再灌注第2天，米诺环素干预组大鼠神经功能评分与模型组之间的差异无统计学意义（10.67±1.03 vs.10.50±1.05,P＞0.05），而缺血再灌注第1、2和4周，米诺环素干预组大鼠mNSS评分明显低于缺血再灌注组（6.33±1.03 vs.7.50±1.22; 4.67±1.03 vs.6.83±0.75;3.33±0.52 vs.5.83±0.75;P＜0.05）；术前各组大鼠楼梯测试左前肢运动功能无明显差异（P＞0.05），术后第2及4周，米诺环素干预组大鼠左前肢抓取食物粒明显多于缺血再灌注组（8.83±1.47 vs.6.33±1.75；9.33±1.21 vs.6.67± 1.03，P＜0.05，表1）。

2.2 米诺环素对脑缺血大鼠RGMa蛋白表达的影响

2.2.1 免疫组化检测大鼠缺血侧皮质RGMa蛋白的表达 免疫组化检测结果显示RGMa蛋白均阳性

表达于神经元细胞膜，呈棕色颗粒。假手术组大鼠缺血侧皮质可见少量RGMa表达，阳性细胞数为（22.00±6.32）。与正常组相比，缺血再灌注2周后，模型组（74.75±9.64）RGMa表达明显增多（P＜0.05），米诺环素干预后RGMa表达量明显降低（49.75±4.50，P＜0.05）（图1）。

2.2.2 Western blot检测大鼠缺血侧皮质RGMa蛋白的表达 免疫印迹检测结果显示，假手术组RG⁃Ma蛋白表达量相对值为（0.31±0.29），缺血再灌注组为（1.17±0.15），米诺环素干预组为（0.53±0.08），模型组RGMa的表达明显高于正常组（P＜0.05），米诺环素干预组RGMa的表达明显低于缺血再灌注组（P＜0.05，图3）。

2.3 米诺环素对脑缺血大鼠GAP-43蛋白表达的影响

2.3.1 免疫组化检测大鼠缺血侧皮质GAP-43蛋白的表达 免疫组化检测结果显示假手术组皮质可见少量GAP-43阳性细胞（19.25±3.40），GAP-43蛋白主要位于细胞核及细胞浆，呈棕褐色，阳性细胞散在分布。缺血再灌注第2周，缺血再灌注组缺血侧皮质GAP-43（30.50±4.66）的表达同假手术组相比明显降低（P＜0.05），米诺环素干预组GAP-43（59.25±8.22）的表达显著增加，同缺血再灌注组相比有统计学意义。

2.3.2 Western blot检测大鼠缺血侧皮质GAP-43蛋白的表达 Western blot检测结果显示，缺血再灌注第2周，模型组GAP-43蛋白的表达（0.57±0.09）高于假手术组（0.27±0.09），同缺血再灌注组相比，米诺环素干预组（0.94±0.10）GAP-43蛋白的表达显著增加，差异有统计学意义（P＜0.05，图3）。

3 讨论

缺血性卒中患者残留严重而持久的神经功能障碍是因为中枢神经系统（CNS）可塑性差，受损的轴突再生困难。目前的研究表明CNS轴突再生障碍的关键因素并不是因为神经元完全丧失了内源性再生的能力，而是因为它们处于一个不利于生长的抑制性微环境[6]。CNS存在多种轴突再生抑制分子包括：硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs），No⁃go-A，髓鞘相关糖蛋白（MAG），少突胶质细胞髓鞘糖蛋白(OMgp)，Semaphorin，Ephrin及Slits等[7-8]。

图1 大鼠缺血再灌注2周后缺血侧皮质RGMa免疫组化染色（标尺：50 μm）A假手术组；B缺血再灌注组；C米诺环素干预组

图2 大鼠缺血再灌注2周后缺血侧皮质GAP-43免疫组化染色（标尺：50 μm）A假手术组；B缺血再灌注组；C米诺环素干预组

图3 Western blot检测各组蛋白的表达 ①假手术组；②缺血再灌注组；③米诺环素干预组

表1 各组大鼠楼梯试验结果

RGMa是近年来发现的一种新的轴突再生抑制因子。人局灶性脑缺血和外伤性脑损伤后，病灶中

心及其周围RGMa蛋白的表达升高[9]。动物实验中同样发现大鼠局灶性脑缺血后RGMa基因和蛋白在缺血侧皮质和海马持续增高，给予RGMa特异性RNA干扰后可显著促进轴突再生，改善大鼠神经功能[10]。本研究也发现大鼠局灶性脑缺血后第2周，缺血侧皮质RGMa表达明显增高，而GAP-43表达较假手术组明显降低，表明RGMa可能参与脑缺血后轴突再生调节。米诺环素作为一种潜在在神经保护剂，因其具有广谱抗炎症、抗凋亡、抗氧化应激及血管保护活性而得到广泛关注[11]。以往的动物实验显示腹腔注射大剂量米诺环素可以促进鼠脑缺血后神经功能的改善[12-13]，Xu[14]等首次报道低剂量米诺环素也可以降低脑梗死体积。本研究前期研究也发现，尾静脉给予低剂量米诺环素（3 mg/ kg）对大鼠缺血性脑损伤具有保护作用，可以减少脑梗死体积，降低血脑屏障的通透性，抑制小胶质细胞的活化及促炎因子HMGB1的释放[15]。Kitaya⁃ma等[16]研究发现，大鼠脊髓损伤后，米诺环素可以抑制病灶周围小胶质细胞的活化，使RGMa表达下调，从而促进轴突的再生。本研究发现尾静脉注射3 mg/kg的米诺环素，能改善大鼠局灶性脑缺血后mNSS及大鼠的前肢运动功能，同Xu[12]等报道一致。并进一步采用免疫组化及免疫印迹法发现，低剂量米诺环素可以抑制缺血侧皮质RGMa的表达并促进轴突再生相关蛋白GAP-43的表达。

综上所述，尾静脉给予低剂量（3 mg/kg）米诺环素可以促进大鼠脑缺血再灌注损伤后神经功能的恢复，其机制可能与抑制缺血侧皮质RGMa蛋白的表达，促进轴突再生相关蛋白GAP-43的表达有关。本研究进一步证明低剂量米诺环素对缺血性脑损伤具有神经保护作用。

[1]Li C,Yuan K,Schluesener H.Impact of minocycline on neuro⁃degenerative diseases in rodents:a meta-analysis[J].Rev Neuro⁃sci,2013,24(5):553-562.

[2]Fagan SC,Waller JL,Nichols FT,et al.Minocycline to improve neurologic outcome in stroke(MINOS):a dose-finding study[J]. Stroke,2010,41(10):2283-2287.

[3]陶涛，秦新月，徐广会.养血清脑颗粒对大鼠脑缺血再灌注损伤后轴突再生及RGMa表达的影响[J].第三军医大学学报,2013,35(7):635-638.

[4]Chen J,Sanberg PR,Li Y,et al.Intravenous administration of human umbilical cord blood reduces behavioral deficits after stroke in rats[J].Stroke,2001,32(11):2682-2688.

[5]Montoya CP,Campbell-Hope LJ,Pemberton KD,et al.The "staircase test":a measure of independent forelimb reaching and grasping abilities in rats[J].J Neurosci Methods,1991,36 (2-3):219-228.

[6]Schimchowitsch S,Cassel JC.Polyamine and aminoguanidine treatments to promote structural and functional recovery in the adult mammalian brain after injury:a brief literature review and preliminary data about their combined administration[J].J Physi⁃ol Paris,2006,99(2-3):221-223.

[7]Muramatsu R,Yamashita T.Concept and molecular basis of axo⁃nal regeneration after central nervous system injury[J].Neurosci⁃ence Research,2014,78:45-49.

[8]梁海乾，李晓红，王景景，等.沉默调节蛋白1促进体外神经元的轴突生长[J].中国神经精神疾病杂志,2014,40(6)：321-324.

[9]Schwab JM,Monnier PP,Schluesener HJ,et al.CNS injury in⁃duced RGM(repulsive guidance molecule)expression in the adult human brain[J].Arch Neurol,2005,62(10):1561-1568.

[10]Feng J,Wang T,Li Q,et al.RNA interference against repulsive guidance molecule A improves axon sprout and neural function recovery of rats after MCAO/reperfusion[J].Exp Neurol,2012, 238(2):235-242.

[11]Plane JM,Shen Y,Pleasure DE,et al.Prospects for minocy⁃cline neuroprotection[J].Arch Neurol,2010,67(12):1442-1448.

[12]Liu Z,Fan Y,Won SJ,et al.Chronic treatment with minocy⁃cline preserves adult new neurons and reduces functional im⁃pairment after focal cerebral ischemia[J].Stroke,2007,38(1): 146-152.

[13]汤建军,赵永波,王铭琴.米诺环素对小鼠脑缺血再灌注后脑水肿的作用及机制研究[J].中国神经精神疾病杂志, 2009,35(7):426-428

[14]Xu L,Fagan SC,Waller JL,et al.Low dose intravenous minocy⁃cline is neuroprotective after middle cerebral artery occlu⁃sion-reperfusion in rats[J].BMC Neurol,2004,4:7.

[15]陶涛,秦新月,秦文熠,等.低剂量米诺环素对大鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用[J].第二军医大学学报,2014,35 (10):1073-1077

[16]Kitayama M,Ueno M,Itakura T,et al.Activated microglia in⁃hibit axonal growth through RGMa[J].PLoS One,2011,6(9): e25234.

Effects of low dose minocycline on the expression of RGMa in a rat model of middle cerebral artery occlu⁃sion and reperfusion

.TAO Tao,QIN Xinyue,FENG Jinzhou.Department of Neurology,the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China.Tel:023-89012478.

ObjectiveTo explore the effects of low dose intravenous minocycline on neurological function and the expression of RGMa in rats after focal cerebral ischemia reperfusion.MethodsFifty-five adult male Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham-operated group,cerebral ischemia/reperfusion(I/R)group and minocycline-treat⁃ed group.The cerebral ischemia/reperfusion model was established by 2 h of middle cerebral artery occlusion.At 2 weeks after ischemia reperfusion,the expression levels of RGMa and growth associated protein 43(GAP-43)were ana⁃lyzed by using immunohistochemistry and Western blot,respectively.Neurological functional recovery was evaluated us⁃ing both the modified neurological severity score(mNSS)and staircase test at 2,7,14 and 28 d after ischemia reperfusion.ResultsMinocycline at a dose of 3 mg/kg via the caudal vein significantly reduced the expression of RGMa protein(0.53± 0.08 vs.1.17±0.15,P＜0.05)and enhanced the expression of GAP-43 protein(0.94±0.10 vs.0.57±0.09,P＜0.05)in isch⁃emic cortex 2 weeks after ischemia reperfusion.Moreover,minocycline could reduce mNSS and improve forelimb motor function when compared to the I/R group(P＜0.05).ConclusionsLow dose intravenous minocycline(3 mg/kg)can im⁃prove neurological functional recovery in a rat model of focal cerebral ischemia reperfusion and the mechanism may be re⁃

R743.31

A

2014-04-14）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2015.03.003

☆ 国家自然科学基金面上项目（编号：30770762）；四川省卫生计生委资助项目（编号：140032）;四川省教育厅资助项目（编号：15ZA0168）；泸州市科技计划项目（编号：2014S4506）

* 重庆医科大学附属第一医院神经内科（重庆 400016）

△ 泸州医学院附属医院神经内科