狂犬病口服疫苗研究进展

（北京中联康生物科技有限公司北京100085）

狂犬病口服疫苗研究进展

路明华，刘延亭，侯艳红

（北京中联康生物科技有限公司北京100085）

狂犬病是一种重要人畜共患病。防制狂犬病的最佳方法是疫苗免疫，而口服是免疫的最佳途径。现口服疫苗的研制取得了许多成果，本文就狂犬病口服狂犬疫苗的研究进展进行了综述。

狂犬病；口服；疫苗

狂犬病（Rabies）是有狂犬病病毒（Rabies virus，RV）引起的一种危害人类健康的最古老的疾病[1]。狂犬病流行广，病毒可感染几乎所有温血动物，是一种危害严重的人兽共患病。据世界卫生组织（WHO）报道，每年至少有50万人进行暴露后疫苗免疫，每年世界范围内病毒感染导致全球有大约5.5万人死于狂犬病，其中大部分发生在发展中国家[2]。该病死亡率100%，目前尚未能有效控制。狂犬病是一种可以用疫苗进行预防的疾病，犬是本病主要传染源，在拉美通过免疫犬使得人和犬狂犬病感染率得到了显著下降，因此通过对犬进行免疫的方法可以更好的控制狂犬病[3-4]。调查表明，我国犬免疫率不足，无法形成免疫屏障，口服疫苗的方式不同于传统注射的免疫方式，更为方便，便于扩大免疫覆盖率，是简便有效的方式。本文就狂犬病口服疫苗的研究现状综述如下。

1 狂犬病病毒疫苗毒株的研究现状

1962年美国科学家首次将狂犬病弱毒疫苗通过胃管导入狐狸的胃中，没有免疫成功[5]，美国CDC于1970年狂犬病弱毒疫苗对狐狸进行口服免疫试验，并比较了CVS、LEP、HEP、ERA株的免疫效果，试验一年后在实验室获得成功，结果表明ERA株具有最好的口服免疫原性，为以后口服疫苗的开发打下了基础。

ERA株源于SAD株，SAD株经瑞士科学家在BHK-21细胞上适应后变为 SAD Bern株和SADswiss株；德国科学家通过BHK21细胞克隆研制出SAD突变株SAD B19。然而，SADBern株和SAD B19株对成年野生啮齿动物、犬和部分野生动物有一定毒力，所以科学家又用单克隆抗体对SAD株进行克隆，选育出SAG1株，该毒株为双缺失株，即病毒糖蛋白的第Ⅲ位点和第Ⅱ位点发生突变，失去了对幼犬及六种成年啮齿类动物的毒力[6]。

SAG2株是由SADBern株选育而来的。SAD B19、SAD Bern和SAG2是目前欧洲用作口服疫苗的毒株。而在美国和加拿大则主要是使用重组牛痘病毒和重组人腺病毒表达的狂犬病毒ERA株糖蛋白，即V-RG和ONRAB[7-10]。

另外还有CTN-1株，CTN-1株是中国科学家用狂犬病街毒经鼠脑传代后成为固定毒，又经二倍体细胞传代得到的二倍体适应株CTN-1株，用该株制备口服疫苗一次免疫可提高长达15个月的保护力[11]。

2 狂犬病口服疫苗的研究现状

在得到合适的毒株后，人们开始寻找简单方便的免疫方式，口服无疑是最佳的选择。于是学者们不断尝试研制狂犬病口服疫苗，到目前为止取得了许多的成果。

郑海发等[12]将CTN-1株经Vero细胞传15代后给犬口服，30 d阳转率为100%，又用10倍剂量给犬口服，取犬脑和唾液在BHK21细胞盲传2代，同时小鼠脑内盲传，进行病毒分离，均为阴性，结果表明该口服疫苗具有较好的安全性和口服免疫原性。

另外，为了延长疫苗对动物机体的刺激时间，缓释材料也被尝试用在疫苗的研制过程中。孙加燕[13]以狂犬病病毒鸡胚低代毒（Flury-lep）为模型，海藻酸钠为缓释材料制备缓释微丸，研制Flury株的口服疫苗，并进行了口服疫苗的安全性、有效性和无菌性研究。结果表明该狂犬病口服疫苗，收到了良好的免疫效果，这就为动物口服疫苗的研究提供了一个新的研究方向。

狂犬病病毒为人兽共患病病毒，不仅要考虑免疫动物的安全性还要考虑对人和环境的安全性，因此狂犬病病毒弱毒则成为活疫苗的最佳选择。Darkaoui S等[14]利用SAG2株制备了口服疫苗，根据WHO推荐的方法分别对农村犬、流浪犬和野生犬进行了口服疫苗的免疫，结果显示三种方式分别有77%、46.7%和73%的诱饵被采食。这表明诱饵对犬有良好的适口性，口服疫苗的方式是可行的。

众所周知，疫苗的保护率是评价一个疫苗的重要指标，所以在提高保护率方面学者们也做了很大努力。Yang DK等[15]通过反向遗传系统构建了一株重组病毒（ERAG3G株），通过口服免疫小鼠研究其效果，并通过肌肉注射免疫猫来观察其安全性。结果全部小鼠均产生对狂犬病毒重组病毒的保护力，猫免疫后28 d中和抗体效价高达2.62～23.9 IU/mL，为口服重组疫苗的研制提供了参考。说明构建的重组病毒可以为动物提供较好的保护。

要达到免疫的作用，主要是要机体产生针对该病毒的中和抗体，而中和抗体的产生并非一定要全病毒的存在，只要能刺激机体产生中和抗体的抗原存在即可，因此可以利用分子生物学的手段得到这些抗原，从而避免使用全病毒，这样安全性便可得到保障。现代分子生物技术的发展为疫苗的研制提供了强有力的工具，使得人们可以按照意愿在病毒基因水平进行改造，从而在狂犬病疫苗的研发中起到了重大的作用。Rupprecht CE等[16]试验了重组狂犬病毒经口服免疫犬后的安全性、免疫原性和效果，并与商品化的以牛痘病毒为载体表达狂犬病毒糖蛋白的重组疫苗效果进行了对比，结果表明，首免后1-2周多数动物都产生了狂犬病毒中和抗体，之后用街毒进行攻毒，对照组全部发病，免疫组均未发病，疫苗对照组有一只发病，显示出该疫苗良好的安全性和效果。Zhang S等[17]制备了以犬腺病毒2型为载体表达狂犬病病毒糖蛋白的重组病毒疫苗的诱饵，并在犬进行试验。用该重组疫苗滴鼻免疫46只犬，口服免疫90只犬。结果表明87.5%的免疫犬产生中和抗体，免疫后2～3周可以检测到免疫反应，5～6周达到高峰90.8%的犬中和抗体持续超过24个月，抗体滴度维持在0.5 IU/mL以上。免疫后2年用60 000只小鼠半数致死量的CVS-24进行10只犬的攻毒试验，犬均存活，显示出重组疫苗口服良好的效果。

由以上可以看出目前口服疫苗的研究多为病毒活载体疫苗及基于反向遗传技术的弱毒活疫苗，而郭恒[18]则利用减毒沙门氏菌为运载体，构建了口服狂犬病疫苗。该研究为狂犬口服疫苗的研制提供了一种成本更加低廉的备选方案。

虽然国内目前在狂犬病口服疫苗方面做了很多的研究，但是尚未有产品上市销售，国际上也仅有两种产品，分别为ONRAB®和V-RG®。Mainguy J等[19]比较了ONRAB®和V-RG®两种口服疫苗的野外投撒效果，抗体产生率结果数据显示ONRAB®疫苗比V-RG®具有更好的免疫效果。

研制出的口服疫苗需要通过上市销售来被使用，企业也需要盈利，这样制作口服疫苗的成本也必须成为考虑因素之一，因此寻找更为廉价的生产方式是必然要求，特别对于发展中国家，这种疫苗更有推广价值。植物为重组蛋白大规模生产提供了新的廉价系统，增加了生产进程。在植物组织中表达的狂犬抗原在肌内和口服免疫后的小鼠身上具有免疫原性和保护性。构建转基因植物是表达外源抗原更为有效的方法之一，为了生产植物源性的狂犬抗原，用烟草的病原相关蛋白基因替代狂犬糖蛋白基因中的信号肽。无论是口服还是肌内注射在小鼠身上植物源性抗原都可以诱导强烈的黏膜和体液免疫反应[20]。虽然植物源性的抗原具有很多优点，但是在植物源性的狂犬疫苗应用到家畜之前还有一些问题需要解决，其中最重要的就是需要提高在未成熟转基因植物中的表达，并且减少不同系和后代中蛋白表达水平的主体性变异。另外，还有必要缩短从不同植物中获取蛋白的时间。另外，狂犬病病毒糖蛋白目前在可食性植物中的表达水平还相当低，如果表达水平方面的技术难题一旦攻破，将为生产安全廉价有效的新型狂犬病口服疫苗提供空前繁荣的前景。

3 展望

犬是狂犬病的主要宿主，动物狂犬病是人狂犬病的根源,已经造成了人类死亡病例的将近99%。消灭动物狂犬病关键要加强对动物的免疫接种，虽然我国狂犬病疫苗经过几十年的发展，已经研制成功安全有效且纯化浓缩的组织细胞狂犬病疫苗，疫苗质量已接近或达到国际先进水平，但其中还存在接种价格昂贵，接种不方便的原因。另外近几年来高新技术在狂犬病疫苗研究广泛应用，以生物反应器培养狂犬病病毒，制备狂犬病的口服疫苗，不仅成本更为低廉，在接种方式上也更为方便，便于大规模的使用，无论是宠物、农村犬还是流浪犬和野生犬，都可以用口服疫苗进行免疫，这样在动物会形成更高的免疫覆盖率，形成免疫屏障，使得狂犬病的发病率和病毒的携带率极大降低，为动物和人类的生命健康做出重要贡献。

在狂犬病口服疫苗的研制方面，笔者认为除了疫苗可以刺激机体产生高效抗体外，还需要对疫苗保存进行研究。口服疫苗的应用不仅限于宠物犬和农村犬，对于流浪犬和野生犬也同样适用，这样疫苗投撒到外部环境后必须在一定的时间、温度和湿度内保持疫苗的免疫效力，否则动物采食后也起不到免疫的效果。因此在疫苗的保护剂方面还需要进行进一步研究。

缓释技术对疫苗的免疫效果同样具有重要的影响，延长免疫原在动物体内的存留时间便可延长疫苗对动物的保护期，因此提高缓释材料对病毒的包埋率，以及减小包埋后对抗原活性的影响是研究重点。

口服的方式是最为方便直接的免疫方式，狂犬病口服疫苗无疑将会成为未来狂犬病疫苗研发的方向。■（编辑：狄慧）

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Progress on Oral Rabies Virus Vaccine

Lu Minghua,Liu Yanting,Hou Yanhong(United Health Co.,Ltd Beijing,100085)

Rabies is a major zoonosis.vaccination is the best way to prevent it,and the best immunity route is oral.As so far,there is a lot of achievements were acquired,so this article reviewed the progress of oral rabies vaccine.

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