新型稀释液TCM199和甘油对牛精液冻存效果研究

桑国俊，郭海龙，王珂，容维中，邱忠玉

（甘肃省畜牧兽医研究所甘肃平京744000）

1 试验目的和要求

近年来的研究表明，在细胞、胚胎冷冻过程中，为了克服低温对胚胎等微小生命的打击，减少或消除细胞和组织间冰晶的形成，必须在培养液中添加一定量的抗冻剂[1]。以前使用的主要是二甲基亚砜（DMSO）或甘油（GL）[2]，但是他们均对细胞或胚胎产生了一定的毒副作用，其中DMSO的毒性比GL强，所以现多用GL[3]。本试验将利用TCM199作为能量和营养素来源[4]，以GL作为冷冻保护剂[5]，多梯度研究TCM199、GL作为稀释剂和冷冻保护剂保护精子的最优剂量，建立新型牛精液稀释和冷冻保存技术。

2 试验设备和要求

种公牛来自宁县兴旺牧业种牛场和甘肃省畜牧兽医研究所牛场。主要设备有人工采精器械、专用保温箱、吸管、冰箱、冷冻仪等。

3 试验方法和步骤

稀释液：按照设计配方、用量进行配制。

冷冻液：第一液为低浓度冷冻液，用于牛精液采集后的第一次稀释；第二液为高浓度冷冻液，用于第二次平衡稀释。

TCM199按照其说明浓度配制，并用酚红和NaOH进行pH标定。GL按照设计添加。

本试验针对以下3种处理实施，即测定不含冷冻保护剂时的精子冻存效果、添加TCM199但不含冷冻保护剂的精子冻存效果、以TCM199和GL为冷冻保护剂时的精子冻存效果。每个水平测定10次（重复），每次制作100枚细管冻精，从中随即抽检10枚，每次抽检测定均在制冻后24 h进行。试验结果用spss统计分析。

4 试验结果

4.1 不含冷冻保护剂时的精子冻存效果

4.1.1 配方组合 本试验系列配方中设计缺失TCM199、乙二醇（EG）和 GL，仅仅用常规能量、抗生素构成稀释液，并进行冷冻保存和解冻观测。目的是评定和掌握牛精液的保存和抗冷冻打击的特性，为下一步试验提供参考数据。各组合配方详见表 1。

表1 不含冷冻保护剂的配方组合

本系列配方中用卵磷脂替代卵黄，添加tris以图进一步提高稀释液的缓冲能力，给精子提供良好的生存环境。

4.1.2 不含冷冻保护剂的细管冻精解冻效果按照试验设计设定的时间，对冻存24 h后的试验冻精进行解冻。解冻时先准备好30℃水浴，将细管冻精在水浴中搅动2～3 s解冻，用细管剪剪掉细管两端封口，分别在安排时段提取该管解冻精液抹片观察和记录，观察温度为25℃。

每组配方测定10枚细管冻精。解冻效果统计详见表2。

表2 不含冷冻保护剂的时冻存冻精的解冻效果

测定结果表明：

1）在不添加冷冻保护剂和稀释剂，但添加果糖等基础营养素的情况下，用超纯水稀释冷冻的牛精液也保持了适度的解冻活力。效果最好的为8号配方，在18 h时的活力仍然维持在0.3的水平。

2）在不添加其它成分，仅仅用超纯水稀释的情况下，解冻冻精也有较高的活力，并且维持了较长时间。如10号配方，刚解冻后的活力有0.45，只是有效活力维持时间短。

3）活力衰减速率不一致。图1是表2资料的图示效果，各组在0～6 h期间的活力下降最快，6～30 h期间活力缓慢下降，30～48 h期间的活力平稳下降。

4.2 添加TCM199但不含冷冻保护剂的细管冻精解冻效果

本项试验中，稀释液仅仅添加了不同剂量的TCM199，未添加 GL和 EG，以便更好地掌握TCM199在牛精液冷冻保存过程中的效果。各组配方和效果测定分述如下。

4.2.1 配方组合添加TCM199但不含冷冻保护剂组的配方详见表3。在测定不同浓度TCM199的同时，在平行配方中还添加了Tris、柠檬酸钠、卵磷脂等。其中 1、2、3、4、7 号添加了 Tris，5、6、8 号添加了柠檬酸钠，9号添加了卵磷脂。

表3 添加TCM199但不含冷冻保护剂组的配方

4.2.2 细管冻精解冻效果 添加TCM199但不含冷冻保护剂组的解冻效果详见表4。

表4 添加TCM199但不含冷冻保护剂组活力测定统计

测定结果表明：

1）在只添加TCM199而未添加冷冻保护剂的情况下，冷冻解冻精液也保持了一定的活力。效果最好的为1号和5号配方，在18 h时的活力仍然维持在0.2～0.3的水平。其它各组合在刚解冻时活力还较高，但持续时间短，活力下降速度快。

2）活力下降高峰期出现在0～6 h阶段。各组下降速度基本一致，在图2中显示出相似的斜率。在6～24 h阶段，各组合活力的下降速度趋缓，但在24～30 h阶段又出现了活力迅速下降的现象，此后精子开始显著衰竭、残缺和死亡，失去了受精能力。

4.3 以TCM199和GL为稀释剂和冷冻保护剂时的精子冻存效果

4.3.1 配方组合

表5中2项试验对不添加TCM199、GL、EG以及不添加GL或EG的稀释液、冷冻液对牛精液的冷冻保存和解冻活力进行了探讨，初步掌握了在这2种情况下牛精液的保存情况，从本项试验开始，将在此基础上，对添加冷冻剂的情况进行深入研究。本项将测定以TCM199和GL为冷冻保护剂时的精子冻存效果。其系列配方详见表5。特点是TCM199梯度增加，GL适度变化，5号配方增加了安钠加。

表5 TCM199+GL的配方组合

4.3.2 TCM199+GL的配方组合细管冻精解冻效果细管冻精的冻存和解冻及测定方法同前项目组。解冻效果详见表6。

表6 TCM199+GL的配方组合冻存冻精的解冻效果统计

测定结果表明：

1）不同浓度TCM199+GL组的冻精解冻活力不同。0～12 h活力 11、2、3号组高于其它组（p＜0.01），同时，1、4、10号也表现出了较高的活力。

2）活力衰减速率不一致。如图2所示。活力衰减比较缓慢的是 1、2、3、4、11 号，减缓比较快的是5、6、7、8、9、10 号。从配方构成看，衰减缓慢的组中TCM199和GL的比例低，衰减快的含量高且添加了柠檬酸钠。11号中TCM199和GL的比例虽然高，但却表现出了本专题试验中最好的曲线，这与缺失果糖和柠檬酸钠有关。

3）综合比较。TCM199本身就是一种复合型营养体，含有细胞生长发育的多种营养成分。添加过多的其它营养物质反而未得到更高的活力表达，如无其它营养素的11号最好，添加了柠檬酸钠和果糖的最差，未添加柠檬酸钠的较好，这在图3中给予了直观反映。

5 结果与分析

通过本次对TCM199、GL组及其对比试验表明：

1）未添加试验成分的牛精液的冷冻解冻效果。本试验的基础液为果糖和超纯水，部分组合中添加了柠檬酸钠、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷冻精液解冻后也表现出了一定的活力，特别是刚解冻后的活力比较高，但在解冻后活力迅速下降，畸形精子迅速增多，可判断为该类精子的受精能力低下，不能用于生产性配种繁育。同时也说明牛精液自身具备良好的抗低温打击能力。

2）以TCM199为主的牛精液冷冻解冻效果。本试验是在基础液果糖和超纯水的基础上，加入了TCM199，同时也在部分组合中添加了柠檬酸钠、tris或卵磷脂，但未添加GL。其冷冻精液解冻后的表现与未添加TCM199和GL的组相似，也表现出了一定的活力，特别是刚解冻后的活力比较高，但在解冻后活力迅速下降，随着时间延长，畸形精子不断增多。效果最好的为1号和5号配方，在18h时的活力仍然维持在0.2～0.3的水平。

3）以TCM199+GL为主的牛精液冷冻解冻效果。本试验是在基础液果糖和超纯水的基础上，加入了TCM199和GL，同时也在部分组合中添加了柠檬酸钠、tris或卵磷脂。其冷冻精液解冻活力明显高于未添加TCM199和GL的组和仅添加TCM199的组。测定表明，不同浓度TCM199+GL组的冻精解冻活力不同。活力高且比较稳定的是11、2、3号组

4）综合分析。通过对3种不同处理及其多样本资源的测定与分析，表明牛精液的处理方法不同，其冻精解冻活力不同。空白处理和仅添加TCM199的处理测定说明了精子本身具有良好的抗低温打击能力，解冻活力较好，但维持时间很短，活力丧失速度快，精子品种不佳，不具备受精能力。TCM199+GL组解冻冻精的质量较高，其解冻精子的活力维持时间较长，精子品质较高。推荐配方为TCM199+GL组的配方11。■

参考资料

[1]邓福金,王化青,吴庆荣.牛精液冷冻机理的探讨[J].中国牛业科学,2013,2（39）:57-59.

[2]贾永宏,朱庆超,杨海涛等.牛精液冷冻保护剂研究进展[J].家畜生态学报,2014,1（35）:5-8.

[3]易康乐,水牛冷冻精液稀释液配方改进的研究[D].中国优秀硕士学位论文全文数据库，2005:1-33.

[4]蔡虹.牛精液冷冻稀释液新配方研究[D].中国优秀硕士学位论文全文数据库2009:1-55.

[5]赵家才,毛翔光,马燕茹等.BMY牛细管冷冻精液生产工艺及稀释液的筛选[J].中国牛业科学,2010,2（36）:19-22.