PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中的功能研究

贾晓琳，王东澍，高志奇，冯尔玲，郑继平，王恒樑，郭桂英，刘先凯



PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中的功能研究

贾晓琳1,2，王东澍2，高志奇2，冯尔玲2，郑继平1,3，王恒樑2，郭桂英1，刘先凯2

1. 海南大学热带生物资源教育部重点实验室，海口 570228； 2. 军事医学科学院生物工程研究所，北京 100071；3. 海南省热带生物资源可持续利用重点实验室，省部共建国家重点实验培育基地；海口 570228

炭疽芽胞杆菌()、蜡样芽胞杆菌()和苏云金芽胞杆菌()均属于蜡样芽胞杆菌群，在遗传学上有很高的相似性。PlcR (Phospholipase C regulator)在蜡样芽胞杆菌中是十分重要的调控因子，但基因在炭疽芽胞杆菌中发生一个无义突变导致在炭疽芽胞杆菌中产生一个截短PlcR蛋白。为了研究基因对炭疽芽胞杆菌功能的影响，文章以蜡样芽胞杆菌CMCC6330基因组为模板，构建重组表达质粒pBE2A-后导入炭疽芽胞杆菌疫苗株A16R中获得重组菌株，对其进行表型分析。结果显示，炭疽芽胞杆菌重组菌株的溶血活性基本没有恢复，但恢复了部分神经鞘磷脂酶活性，表明将蜡样芽胞杆菌的基因导入炭疽芽胞杆菌后，可以直接激活神经鞘磷脂酶活性。

蜡样芽胞杆菌；；炭疽芽胞杆菌；神经鞘磷脂酶；溶血素

PlcR是广泛存在于蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中十分重要的多功能调控因子[1]，它可激活多种编码毒力因子的基因表达，如神经鞘磷脂酶、蛋白酶和溶血素等。在蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌中，PlcR蛋白受PapR的激活，PapR在的控制下以前肽形式表达后通过SecA分泌机制输出到细胞外，在胞外成为激活的五肽形式后，再通过寡肽透性酶系统Opp进入细胞，与PlcR结合并激活PlcR，从而与PlcRbox结合，进而调控染色体上的几十个基因。改变基因的序列可使蜡样芽胞杆菌与苏云金芽胞杆菌中的溶血素和细胞毒素的表达与活性减弱[2,3]。在蜡样芽胞杆菌PlcR缺失株中，一些蛋白质如：神经鞘磷脂酶、溶血素、肠毒素及许多蛋白酶是不表达的[4]。炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌属于蜡样芽胞杆菌群，炭疽芽胞杆菌中存在与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌同源的基因序列，但在炭疽芽胞杆菌当中基因发生了一个无义突变[5]，导致其提前终止，故无法发挥其正常的功能。本文将蜡样芽胞杆菌的基因导入炭疽芽胞杆菌减毒疫苗株A16R(pXO1+pXO2-)中并对其生长状态、溶血酶活性及神经磷脂酶活性进行研究。

1 材料和方法

1.1 菌株及质粒

本实验中用到的菌株及质粒见表1。

1.2 方法

1.2.1 PlcR在A16R中的表达

1.2.1.1 表达载体pBE2A-构建 以CMCC­63301基因组为模板，用引物_F/R(表2)扩增编码区片段，用HⅠ和Ⅰ酶切后连接到本实验室保存的载体pBE2A上，构建重组表达质粒pBE2A-，在该重组质粒中，基因处于枯草芽胞杆菌淀粉酶基因启动子的下游并受其调控。将构建好的重组表达质粒pBE2A-转化到DH5α中，测序正确后，转入大肠杆菌SCS110中去甲基化，后提质粒电击转化到炭疽芽胞杆菌中疫苗株A16R中构建pBE2A-/A16R，同时把表达载体pBE2A也导入A16R中，构建pBE2A/A16R的用作对照。

1.2.1.2 PlcR表达、纯化及抗PlcR多克隆抗体制备 为了将来检测基因是否在炭疽芽胞杆菌中中表达，我们制备了抗PlcR多克隆抗体，具体方法是：以CMCC63301基因组为模板，用引物pET_F/R (表2)扩增片段，用HⅠ和d Ⅲ酶切连接到pET32a载体上，将构建好的质粒化学转化到DH5α中，测序正确后，转化到BL21感受态中，构建pET32a-/BL21，同时用相同的方法构建pET32a/BL21。

表1 本实验中所用到的菌株及质粒

表2 本实验中所用到的引物列表

注：下划线部分表示限制性酶切位点。

pET32a-/BL21诱导表达判断蛋白的可溶性，用可溶性蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。获得纯化好的蛋白后采用背点注射和腹腔注射免疫小鼠。一周后鼠尾取血ELISA测效价，效价比较高时开始眼球取全血，制备鼠多克隆抗体血清。

1.2.1.3 Western blot分析确认PlcR在炭疽芽胞杆菌中表达 将构建的重组菌株pBE2A-/A16R和pBE2A/A16R培养13 h，各收集1 mL培养菌液，离心弃上清，菌体用200 μL纯水重悬，加入等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10 min，离心取上清，进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，将蛋白转印至PVDF膜上，用上述制备的PlcR小鼠多抗进行免疫印迹分析，使用低温凝胶成像仪照相。

1.2.2 表型分析

1.2.2.1 生长曲线测定 在LB琼脂平板上挑取A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单克隆，转接到含5 mL LB液体培养基试管中，在摇床中37℃、220 r/min培养12 h，吸取50 μL转接至新鲜5 mL LB试管中同样条件下培养12 h。吸取1 mL的菌液，转接于含100 mL LB的500 mL三角瓶中培养(37℃，220 r/min)。每隔1 h取出三角瓶，测定600并记录，绘制成生长曲线。

1.2.2.2 溶血现象观察 在平板上挑取蜡样芽胞杆菌CMCC63301、炭疽芽胞杆菌中A16R、pBE2A/ A16R和pBE2A-/A16R单克隆，接到5 mL LB液体培养基试管中，37℃、220 r/min培养13 h，将已灭菌的滤纸片贴到绵羊血平板后，吸取5 μL菌液滴到滤纸片中间待菌液晾干后放置37℃恒温培养箱中培养过夜，观察是否有溶血环及溶血环大小。

1.2.2.3 神经鞘磷脂酶活性观察 在平板上挑取蜡样芽胞杆菌CMCC63301、炭疽芽胞杆菌中A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单克隆，接种到5 mL LB液体培养基试管中，37℃、220 r/min培养菌株13 h，各吸取5 μL菌液滴加到配制好的卵磷脂琼脂培养基(LB培养基+50%葡萄糖水溶液+50%卵黄盐水悬液)中待菌液晾干后放置37℃恒温培养箱中培养过夜，观察是否有乳白色神经鞘磷脂酶消化环及消化环大小。

2 结果与分析

2.1 PlcR在炭疽芽胞杆菌的表达

2.1.1 重组表达菌株构建

表达质粒pBE2A和测序正确的重组质粒pBE2A-电击转化DH5a，用引物pBE2_F/R进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆提取质粒后电转入SCS110去甲基化，用相同引物进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆提取质粒，电转A16R，用相同引物进行菌落PCR鉴定。结果显示重组质粒pBE2A-导入DH5a、SCS110和炭疽芽胞杆菌中A16R中都扩增出特异的条带，证明重组表达载体pBE2A-已成功转入炭疽芽胞杆菌中A16R中。

2.1.2 PlcR蛋白的表达、纯化及抗PlcR多克隆抗体制备

将基因插入到表达载体pET32a中，构建成重组载体pET32a-，转化大肠杆菌DH5a和BL21后，用引物pET_F/R进行菌落PCR鉴定，都扩增出特异明亮的条带，表明表达质粒成功转入到宿主菌DH5a和BL21中。

PlcR在pET32a中表达，融合蛋白大小为51.5 kDa，pET32a-/BL21诱导表达，用His标签抗体进行蛋白印迹，结果显示蛋白条带大小相符，说明PlcR在BL21成功表达(图1)。

图1 重组表达载体pET32a-plcR的构建及PlcR蛋白在大肠杆菌中的表达

2.1.3 Western blot确认PlcR在炭疽芽胞杆菌中表达

挑取pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单菌落，LB培养基中培养13 h后，取菌体1 mL进行SDS-PAGE分析(图2A)，并使用抗PlcR多克隆抗体检测PlcR是否在炭疽芽胞杆菌中A16R中表达。结果显示，pBE2A-/A16R所在的泳道有一条明显的杂交条带，与PlcR大小相符(33.5 kDa)，因而确定PlcR在炭疽芽胞杆菌中A16R中得到表达(图2B)。

图2 PlcR在炭疽芽胞杆菌中A16R中表达

2.2 表型分析

2.2.1 生长曲线

从0时开始每隔1 h测600值最后绘制生长曲线图(图3)。在13 h时炭疽芽胞杆菌中A16R进入对数末期，并且A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/ A16R 3株菌的生长曲线趋势基本相同，差异不太明显。

图3 生长曲线

2.2.2 溶血验证

用蜡样芽胞杆菌CMCC63301做阳性对照，同时选A16R做阴性对照，检测PlcR蛋白表达对炭疽芽胞杆菌中A16R溶血能力的影响。结果显示：37℃培养过夜后，蜡样芽胞杆菌CMCC63301菌苔周围形成明显的溶血环，A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R均没有明显溶血环形成。这表明导入外源基因后A16R的溶血活性没有恢复(图4A)。

图4 重组炭疽芽胞杆菌中溶血酶活性和神经鞘磷脂酶活性检测

2.2.3 神经鞘磷脂酶活性验证

用蜡样芽胞杆菌CMCC63301做阳性对照，同时选A16R做阴性对照，检测PlcR蛋白表达对炭疽芽胞杆菌中A16R神经鞘磷脂酶活性的影响，结果显示：37℃培养过夜后，蜡样芽胞杆菌CMCC63301菌苔周围形成很大的神经鞘磷脂酶消化环，A16R、pBE2A/A16R没有明显的神经鞘磷脂酶消化环形成，pBE2A-/A16R菌落周围有明显的神经鞘磷脂酶消化环形成，但没有CMCC63301强。这表明导入外源基因后A16R的神经鞘磷脂酶活性得到恢复(图4B)。

3 讨 论

在近期对炭疽芽胞杆菌PlcR研究报道中，实验证明导入外源基因能够使炭疽芽胞杆菌中的溶血酶及神经鞘磷脂酶的活性得到恢复[5]。而在本研究中，在导入外源基因后重组菌株pBE2A/ A16R恢复了神经鞘磷脂酶活性，而溶血活性没有恢复，这与文献报道的结果并不完全一致。我们猜测基因在炭疽芽胞杆菌中可能具有多种功能，PlcR蛋白单独就能够激活神经鞘磷脂酶活性，而受基因调控的溶血素基因的激活可能需要与其他基因的共同作用。有研究称受基因调控的毒素基因的表达还需要一个小肽PapR的作用，即PlcR的活性依赖于PapR[7]。位于基因下游70 bp，编码一条48个氨基酸的多肽[8,9]，其功能是细胞与细胞间的信号传递，基因的突变会影响基因的表达，导致溶血素的表达量大量减少[10]，因此，我们推测溶血酶的活性的激活可能需要PlcR与PapR共同作用，但PapR对神经鞘磷脂酶会起到什么样的作用，仍是未知，这需要我们做更进一步的研究。

PlcR不仅能调控其他蛋白其自身的表达也受自身所调控，且N端较为保守，属于DNA结合区域，受PlcR调控基因的启动子区域存在高度保守的回文序列TATGNAN4TNCATA，有报道推测它可能构成了PlcR的识别位点即PlcRbox[2,7]。众所周知，炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌在遗传学上有很高的相似性[11]，而且对基因的进化分析表明，蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌中的基因起源于共同的祖先[12]，那么在炭疽芽胞杆菌中发生的无义突变是在进化过程中自身选择的原因造成的还是另有他因，尚不明确。本实验探究了外源基因对炭疽芽胞杆菌的功能影响，另一方面，将炭疽芽胞杆菌中突变的基因重新突变回正常基因，进而研究其对炭疽芽胞杆菌中功能的影响同样是我们值得考虑的。

因此，我们将构建PlcRpapR融合蛋白及恢复炭疽芽胞杆菌中突变的基因的功能，来进一步研究PlcR在A16R中的功能。

[1] 王玲, 陈亚华, Mahillon J, 喻子牛. 蜡状芽胞杆菌转录激活子PIcR调控多基因的表达. 微生物学报, 2001, 41(3): 304–309.

[2] 黄必旺, 邵恩斯, 蔡瑞, 苏芙蓉, 关雄. 苏云金杆菌毒素调控基因的特性与表达. 激光生物学报, 2010, 19(6): 798–803.

[3] Slamti L, Perchat S, Gominet M, Vilas-Bôas G, Fouet A, Mock M, Sanchis V, Chaufaux J, Gohar M, Lereclus D. Distinct mutations in PlcR explain why some strains of thegroup are nonhemolytic., 2004, 186(11): 3531–3538.

[4] Gohar M, Økstad OA, Gilois N, Sanchis V, Kolstø AB, Lereclus D. Two-dimensional electrophoresis analysis of the extracellular proteome ofreveals the importance of the PlcR regulon., 2002, 2: 784–791.

[5] Mignot T, Mock M, Robichon D, Landier A, Lereclus D, Fouet A. The incompatibility between the PlcR- and AtxA-controlled regulons may have selected a nonsense mutation in., 2001, 42(5): 1189–1198.

[6] 郭兴华, 熊占, 周民, 贾士芳, 许怡. 枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建. 生物工程学报, 1991, 7(3): 224–229.

[7] Grenha R, Slamti L, Nicaise M, Refes Y, Lereclus D, Nessler S. Structural basis for the activation mechanism of the PlcR virulence regulator by the quorum-sensing signal peptide PapR., 2013, 110(3): 1047–1052.

[8] Agaisse H, Gominet M, Økstad OA, Kolstø AB, Lereclus D. PlcR is a pleiotropic regulator of extracellular virulence factor gene expression in., 1999, 32(5): 1043–1053.

[9] Pomerantsev AP, Pomerantseva OM, Leppla SH. A spontaneous translational fusion ofPlcR and PapR activates transcription of PlcR-dependent genes invia binding with a specific palindromic sequence., 2004, 72(10): 5814–5823.

[10] Slamti L, Lereclus D. A cell-cell signaling peptide activates the PlcR virulence regulon in bacteria of thegroup., 2002, 21(17): 4550–4559.

[11] Sastalla I, Maltese LM, Pomerantseva OM, Pomerantsev AP, Keane-Myers A, Leppla SH. Activation of the latent PlcR regulon in., 2010, 156(10): 2982–2993.

[12] Ko KS, Kim JW, Kim JM, Kim W, Chung SI, Kim IJ, Kook YH. Population structure of thegroup as determined by sequence analysis of six housekeeping genes and thegene., 2004, 72(9): 5253– 5261.

(责任编委: 刘钢)

The function of PlcR invaccine strain A16R

Xiaolin Jia1,2, Dongshu Wang2, Zhiqi Gao2, Erling Feng2, Jiping Zheng1,3, Hengliang Wang2, Guiying Guo1, Xiankai Liu2

,andare members of thegroup. They share high genetic similarity. Whereas(Phospholipase C regulator) usually encodes a functional pleiotropic activator protein inandisolates, a characteristic nonsense mutation is found in allstrains investigated, making the gene dysfunctional. To study the function of PlcR in, we used theCMCC63301genome as a template and constructed a recombinant expression plasmid pBE2A-, and introduced it intothevaccine strain A16R, and then analyzed the activity of the hemolysin and sphingomyelinase. The results showed that transformation ofwith plasmid pBE2A-carrying the nativegene active the expression of sphingomyelinase gene, but did not activate expression of hemolysin genes ofA16R.

;;; sphingomyelinase; hemolysin

2015-01-19;

2015-03-12

海南省自然科学基金项目(编号：313043)和海南大学青年基金项目(编号：qnjj1229)资助

贾晓琳，硕士研究生，专业方向：微生物遗传学。E-mail: leibaihe.2008@163.com；王东澍，博士研究生，专业方向：微生物学。E-mail: wangdongshu@foxmail.com贾晓琳和王东澍为并列第一作者。

郭桂英，硕士，实验师，研究方向：微生物学。E-mail: 815827434@qq.com；刘先凯，博士，副研究员，研究方向：病原微生物功能基因组学。E-mail: liuxk007@163.com

10.16288/j.yczz.15-040

2015-3-26 10:08:03

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20150326.1008.001.html