埃博拉病毒疫苗研究进展及相关专利浅析

李有朝, 蔡玉品, 郝 佳

国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心, 北京 100086

埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)疫情从2014年2月开始在西非肆虐，世界卫生组织(World Health Organization，WHO)在2014年9月4日发布消息称，截止到2014年8月31日，几内亚、利比亚和塞拉利昂卫生部在本次EBOV疫情中报告发生了3 865例(可能、确诊和疑似)病例及1 841例死亡；此外，尼日利亚和塞内加尔分别出现了21例(其中7例死亡)和1例[1]，为控制疫情的蔓延，EBOV疫苗开发得到前所未有的关注。葛兰素史克(GlaxoSmithKline Plc，GSK)与美国国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)共同开发EBOV候选疫苗的首个人体试验启动以来，该项目取得重大突破，疫苗已运抵疫区开展临床试验[2]。

埃博拉病毒属于丝状病毒科(Filoviridae)，可引起人及灵长类动物的出血热症状，如急性发热、肌肉酸痛、出血、呕吐和腹泻，肾功能及肝功能损伤，致死率高达88%[3]。EBOV有5种亚型，分别是扎伊尔型(Zaire)、苏丹型(Sudan)、科特迪瓦型(Cote d’Ivoire)、莱斯顿型(Reston)和本迪布焦型(Bundibugyo)[4]。EBOV基因组为单链、负链RNA，编码7个蛋白，分别为包膜糖蛋白(glycoprotein，GP)、衣壳蛋白(nucleoprotein，NP)、基质蛋白(matrix protein)VP24、VP40，非结构蛋白VP30、VP35，以及聚合酶L(polymerase L)[5]。

EBOV侵染细胞的过程部分细节已经明了，EBOV的GP蛋白可能是细胞膜表面受体的配体，与病毒进入细胞有关[6]。通过对GP蛋白及其编码基因的研究发现，该基因含有两个读码框，首先被翻译表达的是一段小肽(sGP)，其以两个二硫键组成二聚体，用来抵御免疫细胞对病毒的杀伤作用，如抑制干扰素的释放[7]，随后该基因通过移码的方式编码出GP，该GP含有GP1和GP2两个亚基，同样是以二硫键形成三聚体[8]，其中GP1负责识别细胞受体，GP2负责诱导宿主细胞的内吞作用，完成侵染[9]。

正是基于GP蛋白在侵染过程中的重要作用，针对EBOV的研究大多集中在GP蛋白上，比如利用GP可以引起机体的免疫反应，GP的肽段被用来制备抗原、抗体，并利用酶联免疫吸附实验诊断EBOV的感染[10]；利用重组杆状病毒表达EBOV的GP蛋白，制备成疫苗，该疫苗可以保护干扰素α/β受体被敲除小鼠免受EBOV的感染[11]；利用有复制活性、无复制活性或化学失活的致病狂犬病毒作为载体表达EBOV的GP，利用所述的重组病毒制备疫苗，制得的疫苗可以诱导体液免疫，并保护小鼠免受致病性狂犬病毒以及小鼠侵染型EBOV的侵染[12]。

至今尚未有疫苗和特效药物上市，WHO已经将EBOV列为生物安全第四级(biosafety level-4)。但是，已经有研究机构或医药公司对EBOV的疫苗的开发提前进行了专利申请以及专利布局。专利申请很大程度上反应理论结果向实际应用的转化。对已有的专利申请进行分析可以获知申请量的消长与何种因素相关；知晓不同国家对埃博拉病毒的关注程度及投入力度；了解各国科研人员关注埃博拉病毒的技术点及其发展趋势；最后对重点专利的剖析将为目前的研究提供相应的启示，为科研机构或医药企业研究有效疫苗或药物提供必要信息。

虽然目前仍未有有效药物或疫苗上市，但是就专利申请而言，已有不少专利获得授权，也已经有产品在进行临床试验，其中在疫情发展过程中便出现了成功治愈被感染者的“ZMapp”，本文将就上述内容进行具体分析。

1 数据来源与方法

本报告的专利文献数据主要来自国家知识产权局的专利检索与服务系统，其中数据库为CNABS数据库以及DWPI数据库，检索截止时间为2014年8月31日。以关键词和IPC代码为主，对EBOV疫苗以及抗体技术相关分类号的检索范围进行检索，检索关键词为：“埃博拉”(伊波拉、依波拉、埃波拉)，Ebola virus，EBOV，疫苗，抗体，vaccine，antibod+；分类号为A61K39+，C07K16+。

经过初步检索，发现中文文献低于150篇，外文文献低于600篇，总体文献数量不是很大，通过人工阅读的方式将疫苗注射方法、通用载体、非以EBOV为主要研究对象以及以佐剂为主题的申请作为噪音排除。

对获得的数据进行分析，对申请年代分布，技术产出地、申请人，申请量与授权量的对比进行分析，最后针对重点申请人的重点申请进行分析，得出目前针对EBOV的专利的关注技术点。

2 结果与分析

2.1 申请量年代分析

图1实线显示了与EBOV密切相关的专利申请年代分布，虽然总体数量不多，但是仍然可以看出，在申请量方面有3个小高峰，分别出现在2003年、2008年和2011年，其中，2001-2005年申请量有一个小平台期，申请量处在高位，经过分析发现，其与全球的埃博拉疫情爆发息息相关，世界卫生组织的网站数据[13]表明，EBOV在2000-2007年间共出现了规模较大的3次爆发，首先是2000年在乌干达爆发的苏丹型埃博拉疫情，感染人数为425例，死亡224例，死亡率为53%，其次在2003年在刚果有143例感染扎伊尔型EBOV，其中死亡128例，死亡率为90%，而在2007年，分别在乌干达和刚果民主共和国又出现了本迪布焦型和扎伊尔型的病例，分别为149例和264例，死亡率分别为25%和71%。在2003-2007年间，除2006年外，每年都有十几例的病例报告(参见图1中虚线，数据来源为世界卫生组织官方网站[13])。由图1可以看出，申请量的小高峰与疫情的爆发年份重合或出现在疫情爆发后1～2年，即2000年和2007年的集中爆发导致全球对埃博拉的病毒关注度提升，科研机构以及医药公司对该病毒的研究投入便会相应增加，表现在申请量上即为在疫情爆发年后1～2年的专利申请小高峰。

2014年的EBOV爆发是1976年以来感染数量以及死亡人数最多的一次，这次疫情将引起人类对EBOV更高的关注度，相信研发投入也会相应提高，因此，预测未来1～2年内，对以EBOV为关键研究对象的专利申请量将会大幅提升，这对我国科研机构和医药公司而言是一个机遇。

图1 申请量与疫情爆发相关性分析Fig.1 Correlation between applications and the outbreak of the EBOV epidemic.

2.2 技术产出地以及申请人分析

图2中显示了EBOV专利申请的技术产出地所占比例，在64篇文献中，91.67%的申请技术产出地为美国，而其他国家如俄国(包含一个苏联时代申请)仅有3件申请，而中国、日本仅有1件专利申请。这与EBOV的研究难度以及所需的资金投入有较大关系。基于安全性的考虑，对实验室的安全级别要求较高，且相对于普通微生物研究相比，其设备、人员的投入也有较高的要求，美国在对埃博拉研究的技术基础以及资金投入上具有优势。

图2 技术产出地分析Fig.2 Analysis of technical output.

图3显示了该领域的重点申请人，略去了申请量少于3个的申请人，通过统计发现，目前对EBOV研究较多的仍是一些非营利性的结构，比如美国卫生与人类发展服务部( United States Department of Health and Human Development Services)以及美国军方，如美国陆军部(The United States of America as Represented by the Secretary of the Army)和美国陆军传染病医学研究所(United States Army Medical Research Institute of Infectious Diseases)，世界较著名的生物制药公司AVI生物医药公司(AVI Biopharma Inc)也仅仅只有3件申请与EBOV相关。可预期的低投入产出比可能是各大医药公司迟迟未进入EBOV药物研究的重要考虑因素，因此，目前为止，对埃博拉的研究还是在以政府主导的机构中进行，就军方背景的申请人推断，EBOV可能是国家层面生物安全方面的重点预防对象。

图3 重点申请人分析Fig.3 Analysis of key applicants.US DEPT：美国卫生与人类发展服务部；US SEC SEC：美国陆军部；US ARMY：美国陆军传染病医学研究所；BAVARI S：Bavari Sina；WARFIELD：Kelly L .Warfield；WISCONSIN：威斯康星校友研究基金会；SCHMAL：Schmal Jone；SANCHEZ：Sanchez Anthony；NABEL GJ：Nabel Gary J； FUNCTIONAL：功能遗传学股份有限公司；AVI BIO：AVI生物医药公司；AMAN：Aman Mohammad Javad。

目前国内相关申请仅为6件，其中只有1件是国内申请人在2014年3月份的申请，其余5件均为国外来华申请。国内申请人为中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所，虽然数量较少，但是申请人与美国的重点申请类似，同样具有军方背景，由此可见，EBOV在国家生物安全方面是全球关注的焦点。

2.3 申请授权比例及重点申请分析

2.3.1申请授权比例 图4显示了在美国获得授权的申请量与申请量的对比分析，其中美国陆军部(US SEC)和美国陆军传染病医学研究所(US ARMY)的授权量较多，几乎占到其申请量的70%以上；AVI生物制药公司的3个申请同样全部获得了授权；而美国卫生与人类服务部(US DEPT)的申请量虽然最多，但其获得授权的量却仅占36.3%。通过查阅相关申请的申请人后发现，美国陆军部和美国陆军传染病医学研究所的申请大部分是作为共同申请人提出的。

2.3.2重点申请技术点分析 通过阅读美国陆军部(US Sec Of Army)在美国的授权专利以及中国的1个申请可以看出最近几年EBOV专利申请的重点关注的技术难点。从事Ebola病毒疫苗研究的相关机构中，美国陆军部授权量最多，为6件(表1)：其中2篇涉及针对EBOV GP蛋白的多克隆抗体；1篇涉及在GP蛋白中发现一个新的CTL抗原表位；1篇涉及GP蛋白和VP40蛋白组成的病毒样颗粒；1篇涉及与VP35结合的抗病毒复合物；还有1篇涉及EBOV GP1蛋白与Marburg病毒GP2蛋白构建嵌合疫苗。

图4 申请授权比分析Fig.4 Analysis of authorization ratio for application.注：图中申请人名称缩写含义与图3中相同。

授权号发明点1US7731975B220100608嵌合GP蛋白疫苗2US7736656B220100615新的GP蛋白抗原表位3US6630144B120031007针对GP蛋白的多克隆抗体4US7682618B220100323包含GP蛋白和基质蛋白VP40的病毒样颗粒5US7507196B220090324与VP35蛋白结合的核酸类似物作为抗病毒复合物6US6875433B220050405针对GP蛋白的多克隆抗体

中国仅有1篇涉及EBOV疫苗的专利申请，处于在审阶段，利用了暴露于GP蛋白表面的中部区域(aa393～556)或其截短体进行诱导。

自本次埃博拉疫情爆发以来，被感染的医护人员中，两名美国医疗援助人员在感染后，在使用名为ZMapp的试验性生物药物后病情好转，通过治疗，两名患者于2014年8月21日康复出院。这引发了人们对ZMapp极大的好奇。通过检索发现，所谓的ZMapp为MApp(Mapp Biopharmaceutical，Inc.)公司研发，包括多种单抗，其中一组单抗为MB-003；另一组单抗则为Defyrus有限公司授权的Zmap-p。

首先，MB-003能够生产上市是因获得了美国陆军传染病医学研究所的授权，能够使用其专利，通过检索发现，所述的专利为表1中的专利3以及专利6，其公开号分别为US6630144 B1以及US6875433 B2。

精读所述的专利发现，专利US6630144 B1涉及识别埃博拉病毒糖蛋白的特异性保护抗体，所述抗体是由细胞系EGP 13F6-1-2(ATCC登录号PTA 373)、EGP 6D3-1-1 (ATCC登录号PTA 374)、EGP 13C6-1-1 (ATCC登录号PTA 375)、 EGP 6D8-1-2 (ATCC登录号PTA 376)和细胞系EGP 12B5-1-1(ATCC登录号PTA 436)分泌的5种单克隆抗体13F6、6D3、13C6、6D8和12B5，虽然所述的专利未公开抗体的序列，但是公开了其针对的抗原序列，具体为：6D8识别GP1 389～405位的氨基酸序列，即 HNTPVYKLDISEATQVE；13F6识别GP1 407～417位氨基酸序列，即EQHHRRTDN；13C6识别SEQ ID NO：10中的保守序列。授权专利US6875433 B2则公开了13F6、6D8、13C6、12B5和6D3的序列信息，包括重链可变区、重链CDRs，轻链可变区以及轻链的CDRs，同时该专利还给出了上述3个抗体的建议中和浓度。

Zmap-p同样也是含有3种单克隆抗体(鼠源单克隆抗体1H3、2G4、4G7)的混合物，在其申请的专利中，公开了所述单抗的识别序列以及抗体氨基酸序列。其中，授权专利US8513391B2公开了1H3的识别序列为sGP蛋白的267～280位，即SNTTGKLIWKVNPEI；2G4识别GP2中的502～516位，即REAIVNAQPKCNPNL；4G7识别GP2中的502～516位，即REAIVNAQPKCNPNL。所述的专利中还公开了上述3株抗体的氨基酸序列信息。

由上述简要分析可知，目前成功的案例MB-003与ZMAb所包含的6种单克隆抗体，其结合位点均针对GP上的表位，其中5种结合线性表位，1种结合构象表位；且表位广泛分布于GP中的sGP、GP1和GP2。因此开发单克隆抗体的针对表位区域应以GP为主，且应尽量采用混合抗体，覆盖多种GP。

目前，MB-003中的单克隆抗体显示GP1序列中的第389～417氨基酸区域是开发结合抗体的较佳区域。此外，融合亚基GP2序列的502～507残基决定不同类型埃博拉病毒的传染性[14]，而ZMAb中的两种单克隆抗体2G4和4G7结合位点也位于GP2序列的502～516位，因此该区域是GP2上一个较好的开发阻断埃博拉病毒传染的单克隆抗体结合的较佳选择区域。

3 讨论

随着对EBOV的基因组、病毒结构的研究深入，其侵染细胞的过程也逐渐明朗，糖蛋白GP是识别细胞膜受体的主要结构，并可能由其介导细胞的内吞作用引发侵染细胞的过程，因此，GP蛋白便成为攻克EBOV的重点关注点。

通过对相关专利的分析可以发现，专利的发明点与最近新发表的非专利科技文献的关注点相同，同样是利用GP蛋白作为抗原，而相对比较成功的案例则具体到以GP1序列中的第389～417位氨基酸区域和GP2序列的502～5016位氨基酸残基制备抗体或者疫苗，且就目前来看，其趋势是由全长蛋白作为抗原制备多克隆抗体到通过植物等宿主以GP蛋白制备病毒样颗粒(VLP)用于疫苗制备，再到利用腺病毒载体表达截断蛋白，用于抗体制备。目前还没有效果特别好的单克隆抗体出现。而疫苗的制备不仅需要抗原，还有相应的佐剂，这可能将会是未来几年的发展方向。

我国虽然申请量较少，起步较晚，为了不重复过往有效药物被国外巨头垄断的老路，我国研究机构或医药公司还需要提高对知识产权的重视程度，在国外巨头形成技术壁垒之前寻找突破口。

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