玉米赖氨酸相关基因opaque-2及其修饰基因研究进展

史庆玲, 董永彬, 周 强, 马智艳, 乔大河, 邓 飞, 李玉玲

河南农业大学农学院, 郑州 450002

玉米是世界三大粮食作物之一，不仅为人类提供粮食和工业原料，而且是动物的优质饲料。玉米品质的好坏不仅关系到玉米的收获加工，更加关系到人畜的营养健康。赖氨酸是人类和单胃动物必需的氨基酸，大约5%的赖氨酸含量才能满足人类的需求，但是普通禾本科植物只能提供1.5%～2%的赖氨酸[1]。高赖氨酸玉米又称为优质蛋白玉米(quality protein maize,QPM)，即玉米籽粒中赖氨酸的含量在0.4%以上，较普通玉米高1倍左右。其主要特点是营养价值高、生物效价比普通玉米高，因此高赖氨酸玉米对于改善人们的营养状况，促进畜牧业发展都有着重要作用。

已有研究表明opaque-2(简称o2)突变基因能够显著提高玉米籽粒的赖氨酸和色氨酸含量[2]。目前基于分子辅助育种技术，利用o2基因及其修饰基因培育优质蛋白玉米是提高其胚乳中的谷蛋白含量和赖氨酸含量的一个有效方法。高赖氨酸玉米育种有广阔的发展前景，具有较好的经济效益和环境效益。本文综述了玉米o2基因及其修饰基因的研究进展，并对当前育种家利用这两种基因相互作用培育优质蛋白玉米的研究进展进行了分析，以期为高赖氨酸玉米育种提供参考。

1 opaque-2基因的研究进展

早在20世纪20年代，Singleton和Jones首次发现玉米opaque-2突变体，并将该基因定位在第7染色体上，在纯合隐性状态下，它能抑制醇溶蛋白的合成，而形成不透明、软质的胚乳表型被广泛用作遗传标记[3]。1964年，Mertz等[2]在玉米胚乳缺陷型突变分析中，发现o2突变体的胚乳蛋白质组分中，醇溶蛋白比例为22.9%，比正常籽粒(55.1%)低；谷蛋白比例为50.1%，比正常籽粒(31.8%)高；赖氨酸含量比正常籽粒高69%，按全籽粒计算则增加一倍。随后o2基因及其等位基因通过转座子标签策略相继被克隆[4,5]。1993年Aukerman等[6]利用spm/en转座子分离到了一个稳定的o2突变体：o2-23。Opaque-2是DNA类绑定蛋白，形成同源二聚体结合到保守的DNA序列上，这个保守序列一般为目标基因启动子的ACGT序列[7]。o2基因编码了一个48 kDa的蛋白，属于玉米胚乳中特异表达的bZIP类转录因子，一般在授粉后10～45 d的胚乳中表达[8]，可转录激活很多基因家族的表达并涉及多种代谢途径。o2基因激活的第一类基因家族是编码22 kDa的α类醇溶蛋白家族，其次还有b-32基因家族(32 kDa的清蛋白)、cyPPDK1(cytoplasmic pyruvate orthophosphate dikinase)基因家族、LKR/SDH基因家族和Ask1(lysine-sensitive aspartate kinase)[9～11]。

在活体细胞中，绝大多数的生理活动主要依靠蛋白与蛋白的互作实现。Opaque-2作为一种重要的转录因子参与了多种调控反应，合成、转运、功能转变及降解等反应都依靠蛋白之间的互作来完成。目前，不少研究已经发现OHP1作为bZIP转录因子，可以与Opaque-2互作形成二聚体发生作用，PBF作为锌指类转录因子可以与22 kDa的醇溶蛋白启动子结合， GCN5和ADA2与Opaque-2形成蛋白复合体直接或间接的调节Opaque-2的表达，Taxilin能通过改变Opaque-2的亚细胞分布来改变Opaque-2的活性[12～15]。

对于转录因子来说，转录后修饰是保证其功能的关键步骤。转录后的蛋白磷酸化修饰作用可以改变转录因子的活性并调节其进入细胞核。2009年Locatelli等[8]研究发现，在胚乳中o2的转录活性分为两个状态：潜在状态和激活状态。在潜在状态时，对称位点发生了去甲基化，DnaseI敏感性增加；在激活状态时o2目标基因的mRNA与o2等一起积累，一些位点的去甲基化和DnaseI敏感性增加。研究还发现，不同的o2目标基因招募的共激活因子不同，他们有不同的染色体修饰模式。

关于o2位点的研究较多、较广，也比较清楚，而且o2突变材料可以显著的降低醇溶蛋白的含量，增加了有益氨基酸赖氨酸的含量，o2位点对醇溶蛋白的调控给高等植物的表达调控提供了一个模式系统，因此该基因是玉米遗传改良的重要资源。但是Zhao等[16]通过分子标记辅助选择将opaque-2基因导入到了12个优良骨干自交系中构建了o2近等基因系(near isogenic line,NIL)，大部分的近等基因系表现了比骨干自交系高的赖氨酸含量，但是在Dan598o2和Liao2345o2中，赖氨酸的含量并没有增加，他们分析认为在一些玉米遗传背景中可能有别的基因控制赖氨酸的含量。2014年，该研究小组在CA339和Liao2345构建的NIL系中又发现了两个表型不同的NIL，liao2345/o2-1有着透明胚乳，liao2345/o2-2有着粉质胚乳，通过分析发现是由于在liao2345/o2-2中启动子序列被rbg转座子插入而抑制了其转录[17]。

2 opaque-2基因的修饰基因

修饰基因是指本身对玉米表型性状不具有任何效应，但却可以与优质蛋白突变体相互作用，并对o2基因的表达起到修饰作用的基因，该修饰基因包含多个复杂的基因遗传位点。富含赖氨酸和色氨酸的o2不透明粉质胚乳玉米籽粒硬度比较低，易受病虫菌危害，产量较低，籽粒成熟时脱水缓慢，机械脱粒时破碎率高、出渣率高，这些缺点妨碍了高赖氨酸和色氨酸玉米在生产上的应用。利用修饰基因的作用可以在不改变蛋白质品质的基础上，有效地控制o2的粉质胚乳向透明胚乳发展。自1969年Paez等[18]发现o2的修饰基因后，玉米育种家就不断地将修饰基因引入粉质胚乳玉米中；1972年Vasal等[19]首先改良了o2型玉米的籽粒硬度和农艺性状，同时又维持了其营养价值，培育成了半硬质、硬质胚乳修饰型o2玉米，其产量水平接近于相同遗传背景的普通玉米。

早在1995年，Lopes等[20]组配了W64Ao2×Pool 33、Pool 33×W64o2和Pool33×W22o2的分离群体，利用RFLP标记定位到2个玉米修饰基因的位点，分别位于7号染色体的着丝粒和端粒附近，尽管这两个位点都位于7号染色体，但是两者之间没有连锁且共显性。

2008年，Holding等[20]利用两套独立的QPM系定位到7个主效o2修饰位点的QTL，分别位于第1、7和9号染色体，7号染色体着丝粒附近为主效QTL(30%)，其他6个效应比较小(5%～12%)。通过微阵列分析重组自交系(recombinant inbreed lines,RIL)群体中透明和不透明的籽粒性状，找到一些差异表达的基因，这些基因位于o2修饰位点的QTL上或是在其附近。一些基因与乙烯和ABA信号有关系，表明o2胚乳修饰位点可能与细胞程序化死亡有关系[21]。

2010年，Gutiérrez-Rojas等[22]利用B73o2和CML161 QPM构成的RIL系，在第3、5、6、8号染色体上定位到与胚乳质地相关的QTL位点，将氨基酸含量的性状定位在了7号和8号染色体上，并且对o2修饰基因与必需氨基酸含量的机理提供了有价值的信息。2011年，Holding等[23]通过粉质胚乳突变体W64Ao2与K0326Y QPM比较发现，K0326Y QPM中有16个基因表达量比o2突变体显著上调，将这些基因列为胚乳修饰基因进行进一步研究。在K0326Y QPM ×W64Ao2组配的314个RIL系中，通过实时定量的方法研究发现有6个基因在透明胚乳RIL系中比不透明胚乳RIL系中有稳定的上升表达。

3 优质蛋白玉米的研究现状

优质蛋白玉米是指包含纯合隐性的o2位点，赖氨酸和色氨酸的含量高，且通过加入一些修饰基因使得籽粒的胚乳足够坚硬的玉米品种[24]。优质蛋白玉米含有的一些相关突变基因在染色体上的分布如图1所示。

我国研究优质蛋白玉米起步比国外略晚，20世纪70年代，在李竟雄的倡导下引入了高赖氨酸玉米种质资源，开始了优质蛋白玉米的选育工作，培育了一批赖氨酸含量高、产量相当于当地推广普通品种的优质玉米杂交种。中单206、鲁玉13和长单58、中单9409等品种已经通过审定，并进行了示范推广。

图1 优质蛋白玉米含有的突变基因在染色体上的分布[25]Fig.1 Distrubution of mutation genes of QPM on chromosome[25].

育种家一般都是利用高赖氨酸种质，通过回交转育的方法来培育高蛋白质玉米的近等基因系，但是不同的遗传背景导入o2后的效果不同。2005年，齐建双等[26]利用o2基因内的SSR分子标记技术结合表型分析，将纯合性基因o2o2导入到了Z58和C72中，在QZ58家系有3种表型，而在QC72中有6种表型。2011年，陈亮等[27]报道了利用18个o2近等基因系与18个普通玉米自交系组配33个杂交组合对产量和配合力进行分析，发现o2在不同的遗传背景下影响不同，其中CAL58×丹598(o2/norma1)、196×辽2345(o2/normal)、196×803(o2/norma1)、CAL58×吉477(o2/norma1)、CA156×196(o2/norma1)这5对组合的产量没有受o2影响。

由于o2基因等位变异比较丰富，包括多种类型的显性和隐性等位基因，在利用分子标记回交转育优质蛋白玉米的过程中，o2供体的选择直接影响选择效率。2011年，赵刚等[28]利用国内常用的优质蛋白玉米自交系CA335、CA339、山东2548和齐205 4个自交系分析发现，4个自交系属于两类不同的o2突变体类型，CA335和CA339为一类，山东2548和齐205为一类。而且这两类突变体作为o2供体选择效果有较大差异，CA335和CA339是优良供体。因此，在优质蛋白玉米的育种中供体选择是关键因素之一。

目前我国广泛使用的是CIMMYT的QPM种质，它属于热带、亚热带种质，它的光周期敏感性阻碍了其在中国的扩增和改良，限制了我国QPM的发展速度。育种家要充分利用我国现有的o2种质资源来发展具有自主知识产权的QPM种质资源。QPM的应用进展比较缓慢，一部分原因是由于导入多个o2修饰位点比较复杂，另一部分原因是使o2位点纯合，检测氨基酸的成分比较困难[29]。但是找到o2修饰位点，研究这些位点的数量、染色体位置和作用机理是培育高赖氨酸玉米的关键。

4 展望

目前，opaque-2被认为可以改变玉米胚乳蛋白的表达模式，增加籽粒赖氨酸的含量。但在2011年，Zhao等[16]研究证明除了opaque-2以外，还有其他基因可以控制醇溶蛋白的合成，而且在个别的玉米遗传背景下赖氨酸的含量不一定能够提高。因此，我们应该更加深入的从分子水平上探究opanque-2基因自身的表达规律及其转录激活的结构基因家族的表达调控机制。

胚乳修饰基因的发掘进展缓慢，而且大部分研究集中在国外，研究仅限于利用传统的育种方法聚合优良基因及利用分子辅助育种选育高蛋白含量的品系。现代基因工程技术快速发展，借助分子生物学技术来发展高品质的玉米品种将会起到良好的效果。

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