山丹黄参多糖对四氯化碳损伤小鼠肝形态结构和TNF-α表达的影响

俞诗源，袁　静，孟　茹，魏娉婷

(1．西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州　730070；

2．西北师范大学学报编辑部，甘肃兰州730070)

山丹黄参多糖对四氯化碳损伤小鼠肝形态结构和TNF-α表达的影响

俞诗源1，2，袁静1，孟茹1，魏娉婷1

(1．西北师范大学生命科学学院,甘肃兰州730070；

2．西北师范大学学报编辑部，甘肃兰州730070)

摘要：研究山丹黄参多糖对四氯化碳(CCl4)致小鼠肝损伤的影响.对40只小鼠先灌胃山丹黄参多糖(12.5，25，37.5 g·L-1)和等量的生理盐水，然后腹腔注射0.2%的CCl4橄榄油溶液，称量小鼠体重、肝重变化，解剖观察小鼠肝脏的形态变化，显微镜观察肝组织结构的变化，免疫组织化学法检测TNF-α在肝组织表达的变化.研究显示，CCl4组小鼠体重明显减轻(P<0.01)，肝重明显增大(P<0.01)，肝脏明显肿胀，肝表面粗糙，有大量脂滴附着，肝脏周围亦有脂状物堆积；肝组织结构不清，细胞炎性坏死，TNF-α蛋白阳性表达明显增强(P<0.01)；山丹黄参多糖各组与CCl4组相比体重显著或极显著增加(P<0.05或P<0.01)，肝重明显减小(P<0.05)，肝脏肿胀明显减轻，肝形态正常，肝脏表面脂滴减少，肝组织结构清晰，TNF-α蛋白阳性表达明显减少(P<0.01).结果表明，四氯化碳对肝组织有明显的损伤效应，山丹黄参多糖具有减少脂质沉着、抑制肝脏肿胀、促进肝脏机能稳定、抑制细胞过度凋亡等作用，能有效减轻四氯化碳对肝组织的损伤.

关键词：山丹黄参多糖；四氯化碳；小鼠；肝形态结构；TNF-α

EffectsofShandanSphallerocarpus gracilispolysaccharide

四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)被广泛用作麻醉剂、驱虫剂、除垢剂等，在工业生产中主要用于制造二氯二氟甲烷和油漆、橡胶的溶剂等，是生产中常用的有机溶剂和民用化学品，已有研究显示CCl4刺激粘膜、麻醉中枢神经，对肝、肾有严重的损害作用，吸入高浓度的CCl4可迅速出现昏迷、抽搐，甚至造成室颤和呼吸中枢麻痹而猝死[1].黄参是多年生纯天然植物，具有重要的药用和食用价值，含有人体必需的各种氨基酸、有机酸、微量元素等[1,2]，具有抗氧化、镇咳、增强免疫等生理功能[3-5]，但山丹黄参多糖对CCl4致小鼠肝脏代谢异常是否有影响尚未见报道，为了搞清黄参多糖对CCl4致小鼠肝代谢异常的影响，笔者通过给小鼠连续灌胃山丹黄参多糖，腹腔注射CCl4橄榄油溶液，观察小鼠肝形态结构的变化，检测肝组织TNF-α表达的变化，研究山丹黄参多糖对小鼠肝损伤的影响，为临床药物损伤的治疗提供依据.

1材料与方法

1.1主要药品和仪器

山丹黄参(购自甘肃省山丹军马场)，冷冻粉碎后按1∶60的料液比蒸馏水提取，70 ℃水浴搅拌2 h，3 000 r·min-1离心(15 min)，取上清液减压浓缩，加三倍体积95%乙醇振荡后静置，3 000 r·min-1离心弃去上清液，冷冻干燥24 h至恒重，即得山丹黄参多糖，用苯酚硫酸法测得多糖含量为61.30%，用时配制成12.5，25，37.5 g·L-1山丹黄参多糖水溶液.

TNF-α抗体、免疫组织化学试剂盒和显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，四氯化碳(Carbon tetrachloride，CCl4)分析纯.

高速台式冷冻离心机(TGL-16M型，Beckman 美国)；旋转蒸发仪(RE52-05型，上海亚荣生化仪器厂)，光学显微镜(Olympus，FX-35WA，Japan).

1.2动物分组及处理

选昆明小鼠40只(20±2)g(兰州大学第一医学院实验动物中心提供)，随机分为对照组，CCl4组，山丹黄参多糖1,2,3组5个组，预饲养1 W后，山丹黄参多糖1，2，3组分别连续灌胃0.2mL浓度为12.5，25，37.5g·L-1的山丹黄参多糖(共28 d，每天上午10.00，下午4.00各1次)，对照组和CCl4组灌胃等量的生理盐水.CCl4组、山丹黄参多糖1,2,3组小鼠再分别腹腔注射0.2%CCl4橄榄油溶液0.2 ml(每3天1次，共9次)，正常对照组腹腔注射等量的生理盐水.

1.3体重和肝重检测

小鼠灌胃或给药后，先称量检测体重，再经眼眶采血、处死，在冰袋上剖开腹腔解剖观察肝脏的形态变化，再取肝脏用生理盐水漂冼后，用电子天平称量肝脏重量.

1.4光镜观察

将肝组织块入15%的福尔马林液固定，做常规石蜡包埋、切片(6 μm)，光学显微镜下观察、摄片.

1.5免疫组织化学观察

取上述肝组织切片脱蜡至水，微波处理修复后，按免疫组化试剂盒说明书，3% H2O2避光孵育以消除内源性过氧化酶活性，山羊血清室温孵育以封闭非特异性反应位点，滴加TNF-α一抗4 ℃冰箱过夜，室温孵育1 h，PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗(羊抗兔IgG)37 ℃孵育30 min，滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液室温孵育，DAB显色，苏木精复染，常规脱水封片，显微镜观察检测肝组织中TNF-α的表达量.

1.6数据采集与处理

从每组免疫组织化学切片中选择形态典型的图片10张，用Image-proplus 6.0图像分析软件检测TNF-α蛋白在小鼠肝组织中阳性反应产物的平均光密度.实验数据用 SPSS 13.0进行统计分析，结果以平均值±标准差(Mean±SD)表示，两组间均数比较(CCl4组与对照组，山丹黄参组与CCl4组)采用双尾t检验，P<0.05表示差异显著，P<0.01差异极显著.

2结果

2.1体重及肝重的变化

山丹黄参多糖影响CCl4损伤小鼠的体重(图1).注射CCl4后CCl4组小鼠体重下降，与对照组相比差异极显著(P<0.01)；与CCl4组相比，山丹黄参多糖各组小鼠体重均又升高，其中，山丹黄参多糖2、3组与CCl4组相比差异显著或极显著(P<0.05或P<0.01)；

山丹黄参多糖影响CCl4损伤小鼠的肝重(图2).与对照组相比，CCl4组小鼠肝脏重量极显著升高(P<0.01)；山丹黄参多糖各组小鼠肝脏重量亦有不同程度升高，但与CCl4组相比，山丹黄参多糖2、3组小鼠肝重显著降低(P<0.05).

山丹黄参多糖影响CCl4损伤小鼠肝脏系数(图3).与对照组相比，CCl4组小鼠肝脏系数明显升高(P<0.01)；与CCl4组相比，山丹黄参多糖各组小鼠肝脏系数明显降低(P<0.05或P<0.01).

图1　小鼠体重变化

**P<0.01 与对照组比较(Compared with the control group)；#P<0.05，##P<0.01 与CCl4组比较(Compared with the CCl4group).下同(The below same)

2.2肝形态结构的变化

山丹黄参多糖影响CCl4损伤小鼠肝脏的形态(图4).对照组小鼠肝脏呈棕红色，表面光滑，质地柔软，形态正常(图4：A)；CCl4组小鼠肝脏肿大，色泽血红，质地变硬且表面比较粗糙，有大量颗粒状白色脂滴，肝脏周围亦有白色油脂状物堆积(图4：B)；山丹黄参多糖各组小鼠肝脏与CCl4组相比，色泽红润，表面光滑，肝肿胀明显减轻，表面颗粒状脂滴明显减小，肝脏周围无明显油脂状物堆积(图4：C).

图2　小鼠肝重变化

图3　小鼠肝脏系数变化

山丹黄参多糖影响CCl4损伤小鼠肝脏的结构(图4).对照组小鼠肝脏结构完好，肝索呈辐射状排列，肝细胞结构清晰(图4：D)；CCl4组小鼠肝脏结构紊乱，肝索不清楚，肝细胞变性坏死，细胞间有大量大小不一的白色脂滴(图4：E)；山丹黄参多糖各组随浓度增高，小鼠肝索趋于清晰，细胞间脂滴消失，坏死细胞数减少，肝组织结构逐渐恢复正常(图4：F-H).

2.3肝组织TNF-α表达的变化

图4小鼠肝脏形态结构和TNF-α表达的变化

Fig 4The change of morphology structure and expression of TNF-αof liver in mice

A.对照组小鼠肝脏，表面光滑，形态大小正常，颜色呈棕红色；

B.CCl4组小鼠肝脏，表面粗糙，颜色鲜红，肿大明显，有明显白色脂滴形成，肝脏周围有白色脂状物沉积(↑)；

C.山丹黄参多糖2组小鼠肝脏，表面光滑，肿胀不明显，有少量白色脂滴(↑)，肝脏周围无脂状物沉积；

D.对照组小鼠肝组织结构，肝细胞结构完整；

E.CCl4组小鼠肝组织结构，有大量炎性坏死细胞，细胞间可见大量大小不一的白色脂滴(↑)；

F.山丹黄参多糖1组小鼠肝组织结构，细胞间脂滴减少(↑)，有少量炎性坏死细胞(↑)；

G.山丹黄参多糖2组小鼠肝组织结构，细胞间脂滴减少至消失，有少量坏死细胞(↑)；

H.山丹黄参多糖3组小鼠肝组织结构，肝组织基本正常；

I.对照组肝组织TNF-α的表达(↑)；

J.CCl4组小鼠肝组织TNF-α的表达(↑)；

K.山丹黄参多糖 1 组小鼠肝组织TNF-α的表达(↑)；

L.山丹黄参多糖 2 组小鼠肝组织TNF-α的表达(↑)；

M.山丹黄参多糖 3 组小鼠肝组织TNF-α的表达(↑).

A.The control group mice liver，surface is smooth，shape and size is normal，presenting brownish red；

B.The CCl4group mice liver，surface is rough，presenting bright red，swollen obviously，there are obvious white fat droplets widely distributed，the liver is surrounded by some white fat deposits(↑)；

C.SGP 2 group liver，surface is smooth，there is a little white fat droplets(↑)，whithout white fat deposits surrounded．

D.The control group liver tissue，liver cells are structural integrity；

E.The CCl4group liver tissue，there are a large number of dead liver cells,a number of different sizes of white fat drops could be seen in the intercellular space(↑)；

F.SGP 1 group liver tissue，intercellular steatosis derease with focal necrosis(↑)；

G.SGP 2 group liver tissue，intercellular steatosis derease and eventually disappeare with intercellular necrosis(↑)；

H.SGP 3 group liver tissue，liver tissue structure look normally；

I.The expression of TNF-αin the liver tissue of control group；

J.The expression of TNF-αin the liver tissue of CCl4group(↑)；

K.The expression of TNF-αin the liver tissue of SGP 1 group(↑)；

L.The expression of TNF-αin the liver tissue of SGP 2 group(↑)；

M.The expression of TNF-αin the liver tissue of SGP 3 group(↑)．

免疫组织化学显示，阳性表达部位被染成棕黄色(图4：I~M)，TNF-α蛋白表达于肝细胞胞浆内.注射CCl4和灌胃山丹黄参多糖后各组小鼠肝

组织都有TNF-α蛋白不同程度的阳性表达，CCl4组表达显著增加，阳性细胞数量多而密集，显色较深(图4：J)，山丹黄参多糖各组TNF-α蛋白亦有阳性表达，但与CCl4组相比阳性细胞较少，且表达量与多糖剂量呈负相关(图4：K~M).TNF-α蛋白表达的平均光密度值见表1.

表1　TNF-α蛋白在小鼠肝组织中表达的平均光密度值

**P<0.01,与对照组比较(Compared with the control group)；#P<0.05，##P<0．01,与CCl4组比较(Compared with the CCl4group)

3讨论

3.1山丹黄参多糖对小鼠体重及肝脏指数的影响

肝脏是机体内最大的消化腺，对糖、蛋白质、脂肪等代谢具有重大意义.γ球蛋以外的球蛋白、酶蛋白及血浆蛋白的生成、维持及调节及氨基酸代谢、许多维生素合成与储存等均与肝脏密切相关.CCl4进入体内后可使肝脏对胰岛素的降解能力降低，促使组织利用葡萄糖增加，造成血糖水平下降[6]， CCl4还可引起大鼠外周血T淋巴细胞比例和白细胞介素显著降低，使机体血浆总蛋白和白蛋白含量下降，造成大鼠免疫失调[8]，使小鼠体重减轻.肝脏参与产热和水、电解质的调节，肝损伤时对钠、钾、铁、磷等电解质调节失衡，肝脏微循环受到影响[7]，造成肝脏重量升高.因此，腹腔注射CCl4后，小鼠体重增长缓慢、肝脏肿大、肝脏系数增加，表明肝组织结构受到破坏造成肝内血液循环异常，导致肝脏代谢紊乱、机体免疫力下降，肝脏出现炎性浸润.山丹黄参富含人体必需的多种氨基酸、矿物质和钙、磷、铁、锌等微量元素[2]，可调节机体代谢活动、增强机体的免疫能力[5]，提高机体对氧自由基的清除能力[4]，灌胃不同浓度的山丹黄参多糖后，机体免疫力增强，微循环得到改善，增强了肝的代谢能力，从而降低了CCl4引起的肝脏炎性损伤，使得小鼠体重逐渐增加，肝脏系数比向正常水平恢复.

3.2山丹黄参多糖对肝形态结构的影响

脂肪酸分解、胆固醇与磷脂合成、脂蛋白合成等均在肝脏内进行.肝细胞胆汁的产生分泌与肝脏胆固醇合成的调节密切相关，胆汁酸是胆汁的重要成分，是脂类食物消化必不可少的物质，也是机体内胆固醇代谢的最终产物.胆汁酸随胆汁流入肠道后，约有95%被肠壁重吸收回肝脏并经肝细胞再处理后释放[8].CCl4进入机体后，引起肝细胞膜、线粒体膜、溶酶体膜等膜类结构的损伤[9]，导致肝细胞发生内质网应激，阻碍了肠肝循环，使固醇调节元件结合蛋白表达增加，造成肝细胞的脂肪变性[10,11]，并引起大鼠肝门静脉压和中心静脉压明显升高[12]，破坏肝被膜，导致部分肝被膜出血和血纤维蛋白析出及以嗜酸性白细胞为主的炎性浸润[13]，在炎症的介导下，肝细胞摄入外源性胆固醇增加，导致肝脏脂质的异常聚集[14].本研究显示CCl4组小鼠肝脏表面欠光滑，周围有白色脂状物堆积，肝脏充血肿胀，肝组织结构紊乱，肝细胞大量坏死，细胞间出现大量白色脂滴，表明CCl4在体内的代谢物影响了肝脏微循环，使胆汁酸的分泌、运输、回收等出现障碍，破坏了胆固醇的代谢平衡，导致炎症反应加剧.植物多糖可修复受损细胞，增强免疫细胞活性[15].本研究显示，山丹黄参多糖各组肝脏形态趋于正常，肿胀明显减轻，表面趋于光滑，肝脏表面脂滴明显减小减少，周围组织脂肪积累减少，肝组织坏死、细胞及胞间脂肪变性明显减少，表明山丹黄参多糖对CCl4所致的肝损伤具有保护作用，其机制可能与多糖抗氧化作用、改善肝脏微循环、增加膜类结构的稳定性、促进蛋白的正确合成与胆固醇的正常代谢有关.

3.3山丹黄参多糖对肝组织TNF-α表达的影响

肿瘤坏死因子(Tumor cecrosis factor，TNF)对维持机体稳态具有重要作用，一定范围内的TNF-α可调节机体的免疫功能，而TNF-α异常分泌又是重要的炎症介质，引起局部炎症反应和器官的损害，过量的TNF表达与肝细胞坏死呈正相关[16]，TNF-α可通过脂类介质和氧自由基，诱导花生四烯酸代谢导致肝组织出血，激活巨噬细胞等方式引起肝损伤[17].CCl4进入机体后可改变细胞膜通透性，使水分及一些离子进入细胞内，导致细胞因细胞器遭到破坏而死亡[9]，由其引起的氧化损伤会刺激TNF-α的表达，进而引起肝脏中NOS活性增加，导致肝内NO含量升高，抑制线粒体呼吸，同时与氧自由基反应生成超氧化亚硝基阴离子损伤细胞，加快了肝细胞的凋亡和坏死[18,19]，所以CCl4组小鼠肝组织TNF-α的表达量增多.肝组织坏死细胞增多.植物多糖对氧化损伤细胞具有保护和修复作用，当归水提液可缓解CCl4所致的线粒体及内质网结构损伤[20]，山丹黄参多糖可能通过促进肝细胞的新陈代谢，抑制超氧自由基的形成，维持细胞的能量代谢和物质运输等途径减少TNF-α在肝组织中的表达，缓解CCl4及其代谢物对肝脏造成的损伤.

参考文献:

[1]薛鸿雁．山丹黄参化学成分及生物活性研究[D]．兰州：兰州理工大学，2011.

[2]贾恢先，邹卿，叶相清，等．山丹黄参的分布及微量元素含量研究[J]．西北植物学报，2001，21(1)：188-190.

[3]陈天仁，罗光宏，祖廷勋，等．黄参螺旋藻保健饮料制备工艺的研究[J]．食品科学，2004，23(1)：121-123.

[4]贾磊，聂秀娟，方梅，等．黄参多糖对小鼠骨骼肌自由基代谢及超微结构的影响[J]．河北体育学院学报，2010，24(5)：58-62.

[5]贾磊，聂秀娟，肖雯，等．黄参多糖干预运动小鼠免疫功能的实验研究[J]．成都体育学院学报，2010，36(7)：72-76.

[6]SEPPALA L A，VEHKAVAARA S，HAKKINEN A M．Fal accumulation in the liver is associated with defects in insulin suppression of glucose production and serum free fatty acids independent of obesity in normal men [J]．JClinEndocrinolmetab，2002，87：3023-3028.

[7]韩德五．肝脏病理生理学[M]．太原：山西高校联合出版社，1992.

[8]王丙云，陈龙，毛鑫智，等．四氯化碳诱导的肝损伤对大鼠免疫机能的影响[J]．中国病理生理学杂志，2009，16(7)：665-666.

[9]王玉卓．灰树花多糖对四氯化碳肝损伤的保护作用及其机制的研究[D]．济南：山东大学，2010.

[10]BRAUERSREUTHER V，VIVIANI G L，MACH F，et al．Role of cytokes and chemokines in non-alcoholic fatty liver disease [J]．WorldJGastroenterol，2012，18(8)：727-735.

[11]SATO R．Stero metabolism and SREBP activation [J]．ArchBiochemBiophys，2010，501(2)：177-181.

[12]胡平，尤行宏，黄丽，等．CCl4所致大鼠肝纤维化门静脉压的变化[J]．中西医结合肝病杂志，2000，10(4)：26-28.

[13]金香男，郑明昱．北沙参乙醇提取物对四氯化碳诱导急性肝损伤的保护作用[J]．长春中医药大学学报，2010，26(6)：828-830.

[14]田琳，刘宏，谢友红．炎症通过SCAP-SREBP2-LDLr途径促进四氯化碳诱导的小鼠脂肪肝细胞胆固醇内流[J]．第三军医大学学报，2014，36(11)：1158-1162.

[15]欧阳建明，彭花．植物多糖对细胞氧化损伤的保护和修复作用[J]．暨南大学学报，2012，33(5)：516-523.

[16]吴卉，唐薇，孙设宗．镁离子、维生素E对诱导的肝损伤TNF-α和caspase-3含量的影响[J]．山西医科大学学报，2013，44(5)：329-332.

[17]褚延魁，吴金生．肝硬变鼠血浆TNF浓度测定[J]．第四军医大学学报，1999，20(2):155-156.

[18]张勇，江隆昌，胡文君，等．TNF-α对人肝细胞Min2基因表达的调节及对线粒体形态功能的影响[J]．世界华人消化杂志，2012，18(32)：3452-3456.

[19]俞诗源，孟茹，李重阳，等.当归多糖对麻黄素小鼠肝组织抗氧化酶活性和NF-KB、TNF-α表达的影响[J]．西北师范大学学报：自然科学版，2015，51(1)：75-81.

[20]宁康健，张子明，司阳洋，等．当归对四氯化碳肝损伤保护作用的电镜观察[J]．中国实验方剂学杂志，2009，15(12)：68-70.

E-mail:syyu006@nwnu.edu.cn

onthehistolomorphstructureandtheexpression

ofTNF-αproteininliverinducedbyCCl4

YUShi-yuan1,2，YUANJing1，MENG Ru1，WEIPing-ting1

(1．CollegeofLifeScience，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu,China；

2．EditorialDepartmentoftheUniversityJournal，NorthwestNormalUniversity，Lanzhou730070，Gansu,China)

Abstract:To investigate the effects of Shandan Sphallerocarpus gracilis polysaccharide(SGP) on the liver histolomorph structure and the expression of TNF-α protein in liver tissue injury induced by carbon tetrachloride(CCl4) in mice,40 mice are gavaged with 0.2 mL SGP at different concentrations(12.5，25，37.5 g·L-1) or physiological saline，and then inject intraperitoneally with doses of 0.2 mL CCl4solution(0.2 % in olive oil).The body weight and liver weight are recorded，the morphologic change of the samples are observed，and the change in the expression of TNF-α in liver tissue are determined by immunohistochemical method．Results show the body weights of CCl4group are significantly decreased，while the liver weights are increased significantly(P<0.01) and swelled markedly，surface is rough and presenting bright red.There are clear white fat droplets，the liver is surrounded by some white fat deposits，positive expression of TNF-α protein increases significantly in liver(P<0.01)．However，the body weights in the SGP groups are significantly increased(P<0.01),but the liver weights are significantly decreased(P<0.05)，the liver swollen is significantly mitigated，surface is smooth，there is a little white fat droplets，no white fat deposits around the liver，positive expression of TNF-α protein decreases significantly in liver(P<0.01)．All results indicate that CCl4has an obvious damage effect on the liver tissue.SGP can reduce lipid composure，inhibit the swollen of the liver and excessive apoptosis of liver cell,promote liver function stability，which can reduce liver tissue damage induced by carbon tetrachloride effectively．

Key words:Sphallerocarpus gracilis polysaccharide；carbon tetrachloride；mice；liver histolomorph；TNF-α

中图分类号：R 338.21

文献标志码：A

文章编号：1001-988Ⅹ(2015)02-0078-07

作者简介：俞诗源(1957—)，男，甘肃兰州人，教授，博士，博士研究生导师.主要研究方向为发育生物学和毒理学.

基金项目:甘肃省自然科学基金资助项目(1107RJZA141);兰州市社会发展项目(2013-3-72，2014-1-102)

收稿日期：2014-10-06;修改稿收到日期:2014-11-20