γ射线照射对小鼠皮肤缺损创面愈合的影响及其机制探讨

王慕，徐丽,周志钢，董肇杨，唐雪鸿，曾勇，朱丽倩(武警上海市总队医院，上海201103)



γ射线照射对小鼠皮肤缺损创面愈合的影响及其机制探讨

王慕，徐丽,周志钢，董肇杨，唐雪鸿，曾勇，朱丽倩(武警上海市总队医院，上海201103)

摘要：目的观察γ射线照射对小鼠皮肤缺损创面愈合的影响，并探讨其可能的机制。方法将60只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为观察组和对照组，各30只。观察组采用60Co-γ射线(6 Gy)照射小鼠全身5 min，照射后腹腔麻醉消毒，于小鼠背部造成深及筋膜的1 cm×1 cm大小皮肤缺损创面，用TegadermTM贴膜覆盖创面后隔日换药。对照组不予射线照射，其余处理同观察组。两组于造模后第3天(T0)、7天(T1)、14天(T2)，采用Image Proplusv1.5图像分析系统测量残余创面面积，记录创面组织新生毛细血管及成纤维细胞数量，采用Real-time PCR法检测创面组织血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维因子2(FGF-2)、血小板衍生因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)mRNA相对表达量。结果随着时间的延长，两组残余创面面积逐渐减小，创面新生毛细血管及成纤维细胞数量均先升高后降低。观察组各时点残余创面面积均超过对照组，T0时点新生毛细血管数量和T0、T1时点成纤维细胞数量均低于对照组，P均<0.05。观察组T0、T1时点VEGF、PDGF、TGF-β和各时点FGF-2 mRNA相对表达量均低于对照组，P均<0.05。结论γ射线照射可以导致小鼠皮肤缺损创面愈合延迟，可能与其降低血管生成因子和成纤维因子表达，从而抑制新生血管和肉芽组织形成有关。

关键词：放射损伤；γ射线；皮肤缺损；创面愈合；促血管生长因子；转化生长因子β；小鼠

临床放射治疗、核事故及核爆炸等均可造成慢性放射性创面损伤，使局部创面细胞生存环境发生巨大变化，特别是当此类患者同时合并深层组织损伤时，伤口愈合极其困难[1]。研究发现，促进血管再生的细胞分子如血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维因子2(FGF-2)、血小板衍生因子(PDGF)、转化生长因子β(TGF-β)，在组织修复、创面愈合的过程中发挥重要作用[2，3]。但是，放射性损伤组织愈合困难是否与上述生长因子的表达异常有关鲜见报道。2012年3月～2013年10月，我们观察了γ射线照射对小鼠皮肤缺损创面愈合的影响，并对创面组织中的相关细胞因子进行检测，为探讨其影响创面愈合的机制提供新思路。

1材料与方法

1.1材料健康雄性C57BL/6小鼠60只(上海第二军医大学实验动物中心提供)，3～4 周龄，体质量(20±2)g。1%戊巴比妥钠，北京冬哥科技有限公司；60Co-γ射线，上海第二军医大学放射医学实验室；4%多聚甲醛溶液、石蜡，上海振普生物科技有限公司；液氮，上海加杰特种气体有限公司；紫外分光光度仪，上海元析仪器有限公司；SYBR PT-PCR试剂盒，美国RD公司。

1.2造模与分组将60只健康雄性C57BL/6小鼠随机分为观察组和对照组，各30只。观察组采用60Co-γ射线(6 Gy)照射小鼠全身5 min，照射后采用1%戊巴比妥钠按40 mg/kg体质量进行腹腔麻醉，平板固定小鼠四肢，75%乙醇消毒小鼠背部，在其背部造成深及筋膜的皮肤缺损创面(1 cm×1 cm)；采用TegadermTM贴膜覆盖创面，伤后隔日换药，独笼饲养。对照组不予射线照射，其余处理同观察组。

1.3相关指标观察

1.3.1残余创面面积两组于造模后第3天(T0)、7天(T1)及14天(T2)，在TegadermTM贴膜上沿小鼠背部创伤创缘划线，采用Image Proplusv1.5图像分析系统测量残余创面面积。

1.3.2创面组织新生毛细血管及成纤维细胞数量两组于各时点测量残余创面面积后分别注射过量麻醉药物处死小鼠10只，取创面组织(包括伤口周围部分正常皮肤和创面下方的薄层肌肉组织)。部分创面组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，组织切片后行HE染色。于高倍(×4 000)显微镜下观察，每张切片上下左右分别随机选取3个视野，计数视野内的新生毛细血管和成纤维细胞，取平均值。其余组织保存于液氮中备用。

1.3.3创面组织VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β mRNA相对表达量采用Real-time PCR法。取保存于液氮中的创面组织，按TRIzol试剂盒说明步骤提取总RNA，紫外分光光度仪检测A260/A280值, 计算RNA浓度，反转录合成cDNA。以GAPDH为内参，利用SYBR PT-PCR试剂盒及实时定量PCR系统检测组织VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β mRNA相对表达量。各引物序列见表1。PCR反应体系10 μL：10×buffer 2 μL、混合引物2 μL，cDNA模板1 μL、SYBR Green 0.4 μL、dNTP 2 μL、Tap酶0.4 μL ,余用双蒸水补足。PCR反应条件：95 ℃预变性 5 min，95 ℃ 变性30 s，58 ℃退火30 s，在72 ℃下延伸10 s；其中VEGF进行26个循环，TGF-β进行28个循环，PDGF进行32个循环，FGF-2进行32个循环，最后72 ℃延伸10 min。检测均进行3次，取平均值。mRNA相对表达量以2-ΔΔCt表示。

表1　VEGF、FGF-2、PDGF、TGF-β及GAPDH引物序列

2结果

2.1两组各时点残余创面面积、新生毛细血管及成纤维细胞数量比较随着时间的延长，两组残余创面面积逐渐减小。观察组各时点残余创面面积均超过对照组，T0时点新生毛细血管数量和T0、T1时点成纤维细胞数量均低于对照组，P均<0.05。见表2。

2.2两组各时点创面组织各因子mRNA表达比较观察组T0、T1时点VEGF、PDGF、TGF-β和各时点FGF-2 mRNA相对表达量均低于对照组，P均<0.05。见表3。

表2　两组各时点残余创面面积、新生毛细血管

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

表3　两组各时点创面组织各因子mRNA

注：与对照组同时间点比较，*P<0.05。

3讨论

创伤愈合的修复过程中一般会先发生局部炎症反应，继而形成肉芽组织并不断增生，随后新生组织不断地再生、重建修复。其中，肉芽组织的形成是创伤愈合的关键，而新生毛细血管形成以及成纤维细胞增殖是形成肉芽组织、促进缺损伤口愈合的主要因素。γ射线波长较短、电离密度较低、穿透力较强，易透过皮肤达深层组织，故在放疗及辐射性损伤中多引起皮肤及深层软组织的损伤；同时也可以对机体的胃肠系统、呼吸系统及中枢神经系统造成损伤。本研究中γ射线照射的观察组各时点残余创面面积均明显超过对照组，也证明了皮肤放射性损伤修复困难。其机制相对复杂，可能与新生血管及造血细胞的形成、成纤维细胞等修复细胞功能的改变、间质胶原合成降低等诸多因素有关[4]。本研究中无论是单纯创伤还是放射性损伤，在创伤的修复过程中均存在新生毛细血管数量及成纤维细胞数量先升高后降低的发展趋势，观察组基本上低于对照组。分析原因，可能是创伤早期主要以炎性反应为主，刺激了血管内皮细胞以及成纤维细胞的增生，并使之达到一个相对较高的峰值，而后期随着炎性反应的减弱，新生的毛细血管及成纤维细胞的增殖速度也会逐渐降低。对于放射性损伤而言，创面在放射性物质的作用下，愈合过程相对滞后，因此新生毛细血管及成纤维细胞数量相对较少。

皮肤放射性损伤缺损创面在愈合过程中，机体分泌的影响新生血管形成的生长因子发生变化，进而影响创伤的愈合速度。因此，新生血管形成障碍是导致愈合延迟的主要因素之一[5，6]。VEGF、FGF-2、PDGF等促血管生长因子在新生血管形成过程中发挥重要作用[7～9]。VEGF通过刺激和作用于细胞表面的受体(VEGFR-1、-2、-3)而发挥生物学效应，这些受体属于酪氨酸激酶家族中的血小板源性生长因子受体。VEGF可以促进血管内皮细胞特异性分裂增殖，提高新生血管的生成速度；同时使血管通透性增加，血管内成分渗漏，作为基质使血管内皮迁移，形成新的毛细血管[10]。FGF-2做为FGF家族中的主要成员，是目前已知的最强的促细胞生成因子，可诱导内皮细胞增殖，并使血管的通透性增加，在创伤愈合及损伤组织修复过程中的新生血管生成阶段发挥至关重要的作用。血管的形成过程主要包括小动脉和毛细血管的形成，其中VEGF在毛细血管形成中发挥促进作用，而FGF-2则主要促进小动脉的形成[11]。研究表明，VEGF和FGF-2在微血管内皮细胞形成过程中相互作用，FGF-2使VEGF的表达升高，同时内皮细胞通过产生的VEGF促使FGF-2诱导血管生成，并可提高内皮细胞的增殖能力[12，13]。PDGF也是一类由血小板及巨噬细胞分泌的重要生长因子，在创伤的愈合过程中，创面成纤维细胞及平滑肌细胞在渗出液中PDGF的作用下不断增殖，进而促进肉芽组织生成[14]。同时也使参与创面修复过程中的各种炎症细胞趋化至创面，使周围的细胞及血管平滑肌细胞渗透至毛细血管内，提高新生血管的完整性；并可使成纤维细胞不断增殖，激发形成细胞外基质[15]。上述促血管生成因子多参与创伤愈合早期的炎性反应，并使微血管的渗透性发生改变，更有利于外周细胞进入到毛细血管中，加快周围基质的形成。本研究中观察组创伤第3、7天VEGF、PDGF及创伤后各时点FGF-2 mRNA相对表达量均明显低于对照组，其原因可能是射线导致缺损创面分泌上述因子的巨噬细胞、角质细胞数量减少，继而引起促进血管生成因子表达降低，最终导致伤口愈合延迟。

纤维组织的形成也是促进创伤愈合的主要因素，射线会导致缺损创面成纤维细胞数量及功能发生变化，从而导致创伤愈合延迟。TGF-β可以引起成纤维细胞趋化，参与细胞外基质的基因转录和蛋白质合成，促进形成肉芽组织[16，17]。本研究中对照组TGF-β在创伤第7天达到峰值，可能与此时炎症反应减弱而肉芽组织增生增强有关；而观察组TGF-β表达先降低后升高，且表达明显低于对照组，提示放射性损伤愈合过程中TGF-β表达变化相对滞后，同时肉芽组织形成缓慢，导致创口延迟愈合。

综上所述，射线可以导致小鼠皮肤缺损创面愈合延迟，可能与其降低促血管生长因子(VEGF、FGF-2、PDGF)的表达而造成新生血管数量减少，降低TGF-β表达而抑制肉芽组织形成有关。如针对上述细胞因子表达变化给予纠正及治疗，有望为临床放射性损伤的治疗提供新思路。

参考文献：

[1] Olascoaga A, Vilar-Compte D, Poitevin-Chacon A, et al. Wound healing in radiated skin: pathophysiology and trend opinions[J]. Int Wound J, 2008,5(2):246-257.

[2] Lauer G, Sollberg S, Cole M, et al. Expression and proteolysis of vascular endothelial growth factor is increased in chronic wounds[J]. J Invest Dermatol, 2000,115(1):12-18.

[3] Douglas HE. TGF-β in wound healing:a review[J]. J Wound Care, 2010,(9):403-406.

[4] Carnevali S, Mio T, Adachi Y, et al. Gamma radiation inhibits fibroblast-mediated collagen gel retraction[J]. Tissue cell, 2003,35(6)：459-469.

[5] Wicks K, Torbical T, Mace KA, et al. Myeloid cell dysfunction and the pathogenesis of the diabetic chronic wound[J]. Semin Immunol, 2014,26(4):341-353.

[6] Galiano RD, Tepper OM, Pelo CR, et al. Topical vascular endothelial growth factor accelerates diabetic wound healing through increased angiogesis and by mobilizing and recruiting bone marrow-derived cells[J]. Am J Pathol, 2004,164(6)：1935-1940.

[7] Johnson KE, Wilgus TA. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis in the regulation of cutaneous wound repair[J]. Adv Wound Care, 2014,3(10):647-661.

[8] Yan J, Chen Y, Yuan Q, et al. Comparison of the effects of Mg-6Zn and Ti-3Al-2.5V alloys on TGF-β/TNF-α/VEGF/b-FGF in the healing of the intestinal tract in vivo[J]. Biomed Mater, 2014,9(2):25011.

[9] Barrientos S, Stojadinovic O, Golinko MS, et al. Growth factors and cytokines in wound healing[J]. Wound Repair Regen, 2008,16(5):585-601.

[10] Shibuya M. VEGF-VEGFR System as a Target for suppressing inflammation and other diseases[J]. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets, 2015,15(2):135-144.

[11] Lang I, Hofmann C, Olip H, et al. Differential mitogenic responses of human macro vascular and mierovascular endothelial cehs to cytokines underline their phenotypic heterogeneity[J]. Cell Prolif, 2001,34(3):143-155.

[12] Seghezzi G, Patel S, Ren CJ, et al. Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) induces vascular expression in the endotheial cell of forming ca illaries: an autocrine mecha nism contributing to angiogenesis[J]. J Cell Biol, 1998,14(7):1659-1673.

[13] Tokuda H, Hirade K, Wang X, et al. Involvement of SAPK/JNK in basic fibroblast growth factor-induced vascular endothelia growth factor release in teoblasts[J]. J Endocrinol, 2003,177(1):101-107.

[14] Uutela M, Wirzenius M, Paavonen K, et al. PDGF-D induces macrophage re-cruitment,increased interstitial pressure, and blood vessel maturation during angiogenesis[J]. Blood, 2004,104(10):3198-3204.

[15] Pierce GF, Mustor TA. Pharmacologic enhancement of wound healing[J]. Annu Rev Med, 1995,(46):467-469.

[16] Watelet JB, Gevaert P, Bachert C, et al. Secretion of TGF-β1, TGF-β2, EGF and PDGF into nasal fluid after sinus surgery[J]. Eur Arch Otorhinolaryngol, 2002,259(5):234-238.

[17] Shindel AW, Lin G, Ning H, et al. Pentoxifylline attenuates transforming growth factor-β1-stimulated collagen deposition and elastogenesis in human tunica albugineaderived fibroblasts part 1: impact on extra-cellular matrix[J]. J Sex Med, 2010,7(6):2077-2085.

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Effect of γ-ray on wound healing of skin defect in mice and its mechanism

WANGMu,XULi,ZHOUZhi-gang,DONGZhao-yang,TANGXue-hong,ZENGYong,ZHULi-qian

(ArmedPoliceHospitalofShanghai，Shanghai201103，China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of γ-ray on wound healing of skin defect in mice and to explore its mechanism. MethodsA total of 60 healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into the control group (n=30) and observation group (n=30). Those C57BL/6 mice in the observation group were irradiated 5 minutes with a single dose of60Co-γ-ray (6 Gy). After the mice were anesthetized and sterilized, 1 cm×1 cm wound to fascia on the back was made, the wound was covered by the TegadermTM paster, and we cleaned the wound every other day. Those mice in the control group were not irradiated, and the other treatments were the same as that in the observation group. The wound residual area was measured using Image analysis system (Image Proplusv 1.5) in the two groups on day 3 (T0), 7 (T1) and 14 (T2) after damage, and the number of new capillaries and fibroblasts in wound were observed at the same time. The mRNA expression levels of vascular endothelial growth factor (VEGF), basic fibroblast growth factor-2 (FGF-2), platelet-derived growth factor (PDGF) and transforming growth factor-β (TGF-β) in the dermal defects were detected by Real-time PCR. ResultsWith the extension of time, the residual wound areas gradually reduced in the two groups, and the newborn capillaries and fibroblasts in wound first increased and then decreased. The residual wound areas were larger in the observation group than those of the control group at different time points. The number of new capillaries at T0, and the number of fibroblasts at T0and T1in observation group were lower than those of the control group at the same time points (all P<0.05). The mRNA expression levels of VEGF, PDGF and TGF-β at T0and T1and the FGF-2 mRNA expression level at each time point in the observation group were lower than those of the control group at the same time points (all P<0.05). ConclusionThe γ-ray can delay the wound healing of skin defect in mice, and it may be related with the decreased expression of angiogenesis factor and fibroblast factor and inhibition of the angiogenesis and granulation tissue formation.

Key words:radiation injury; γ-ray; skin defect; wound healing; angiogenic growth factors; transforming growth factor-β; mice

收稿日期：(2015-09-11)

中图分类号：R818

文献标志码：A

文章编号：1002-266X(2015)48-0015-04

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.48.005

作者简介：第一王慕(1976-)，女，主治医师，研究方向为整形、创伤修复。E-mail: 308375881@qq.com

基金项目：上海市卫生和计划生育委员会科研课题(20114341)。