一测多评法测定三颗针中4种生物碱类成分的含量

田妮娜 ，封士兰 ，周 丽

（1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000；3.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004）

一测多评法测定三颗针中4种生物碱类成分的含量

田妮娜1，2，封士兰1，周 丽3

（1.兰州大学药学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州市食品药品检验所，甘肃 兰州 730000；3.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004）

目的建立三颗针中小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺一测多评法，验证该方法的可行性和技术适应性。方法 以小檗碱为指标，计算巴马汀、尖刺碱、小檗胺与小檗碱的相对校正因子，并用该校正因子进行巴马汀、尖刺碱、小檗胺的含量计算，同时采用外标法测定三颗针中该4种生物碱的含量，并比较外标法与一测多评法的结果，以验证一测多评法的准确性和可行性。结果 外标法与一测多评法的结果无显著性差异（RSD＜5.0%）。结论 以一测多评法测定三颗针中小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺的含量是准确可行的。

一测多评法；三颗针；生物碱；外标法

三颗针为常用中药，是小檗科植物拟獠猪刺、小黄连刺、细叶小檗或匙叶小檗等同属数种植物的干燥根，主要用于湿热泻痢、黄疸、湿疹、咽痛目赤等症，小檗碱的含量是目前对三颗针药材、饮片质量控制的主要依据[1]。但随着对三颗针生物活性及化学成分的深入研究，发现巴马汀、小檗胺、尖刺碱均具有较为显著的生物活性，且含量较高[2～4]，在多个品种中均有分布，亦可纳入三颗针药材质量控制体系。目前虽有用高效液相色谱法测定三颗针中小檗碱、巴马汀的含量[5]，但因某些对照品（如尖刺碱提纯难度较大）难以获得或分析成本过高等，还未见用外标法同时测定三颗针中小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺含量的文献报道，这对三颗针药材进行多指标质量控制造成了较大困难。

一测多评法（QAMS）以样品中某一成分为内参物，建立该成分与其他成分间的相对响应因子，通过相对响应因子计算其他成分含量。该方法能有效解决多指标质量控制面临的对照品短缺和检测成本高昂等问题，实现了多成分同步测定[6]，目前已应用于黄连、补骨脂、虎杖等中药的质量评价[7～9]，其中黄连一测多评的含量测定方法已收入2010年版《中华人民共和国药典》。

针对三颗针中生物碱类对照品外缺现状，为满足对三颗针进行全面质量监控的迫切需求，笔者应用一测多评法对三颗针中小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺的含量进行测定，从而对三颗针进行多指标质量控制。以价廉易得的小檗碱作为内参物，通过建立其与巴马汀、尖刺碱、小檗胺的相对校正因子进行含量计算，并考察该方法的耐用性及系统适用性，探讨一测多评法在三颗针药材多指标质量评价中的适用性和准确性。

1 仪器与材料

Thermo U3 000高效液相色谱系统，Chromeleon 7.1工作站，Agilent 1 260高效液相系统，Agilent chemstation工作站；AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK

C18 MG II(4.6 mm×250 mm，5μm)；KQ-100 超声仪（ 40 KW）；乙腈、甲醇为色谱纯，水为高纯水，其余试剂均为分析纯。盐酸小檗碱（110 713-201 212）和盐酸巴马汀（110 732-201 309）购自中国药品生物制品检定所，盐酸尖刺碱（1 745-1）和盐酸小檗胺（A0 619）购自北京普天同创生物科技有限公司，三颗针药材和饮片购自四川、贵州、云南等地，经兰州大学药学院封士兰教授鉴定为细叶小檗的干燥根。

2 方法与结果

2.1 一测多评方法学考察

2.1.1 色谱条件 色谱柱为AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm ×250 mm，5μm)；流动相为乙腈 -0.02mol／L磷酸二氢钾溶液(25∶75)，柱温30℃，流速0.6ml·min-1，检测波长232 nm。在上述色谱条件下，各组分离度良好，见图1。

图1 三颗针药材中4种生物碱色谱图

2.1.2 对照品溶液的制备 取小檗碱、巴马汀、尖刺碱与小檗胺4 种生物碱，精密称定，分别为 7.63、8.04、16.38、11.28 mg 置于10m l量瓶中，用甲醇定容至刻度，精密移取上述4个对照品溶液各1m l，置于50 m l量瓶中，加甲醇定容至刻度，为混标溶液。将上述混标保存于4℃冰箱中，备用。

2.1.3 供试品溶液的制备 取本品三颗针药材粉末（过40目筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇—盐酸（ 90∶1）50 m l，密塞，称定重量，水浴回流 30 min，再超声处理(功率250W，频率40 kHz)1h，放冷，再称定重量，用甲醇—盐酸（90∶1）补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45μm滤膜，5μl进样。

2.1.4 线性范围 精密吸取上述混合对照品溶液40、30、20、10、8、6、4、2、1μl，进样分析，每个浓度进样 3 次，取平均值。以进样量对峰面积积分值进行回归处理，得巴马汀、尖刺碱、小檗胺与小檗碱的回归方程（见表1）。

表1 三颗针药材中4种生物碱的回归方程

2.1.5 校正因子计算 以小檗碱为内标物，计算小檗碱对巴马汀、尖刺碱、小檗胺的校正因子，见表2。

表2 三颗针药材中各生物碱的相对校正因子

2.1.6 精密度实验 精密吸取同一供试品溶液5μl，于同一天内连续进样5次，记录小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺的峰面积，得出日内精密度分别为0.9%、0.8%、0.6%、1.3%；精密吸取同一供试品溶液5μl连续进样3 d，每天3次，记录峰面积，以上4个生物碱成分的日间精密度分别为 2.1%、1.5%、1.4%、2.8%。表明仪器较为稳定。

2.1.7 稳定性实验 精密吸取同一供试品溶液5μl，分别于配制后的 0、2、4、8、12、24 h 测定面积积分值，小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺稳定性的RSD分别为1.3%、1.1%、2.2%、0.9%。表明处理后的样品在24 h内稳定。

2.1.8 重复性实验 称取三颗针（产地四川）药材粉末（40目）约0.1 g共6份，精密称定，按“2.1.3”项下制备样品，测定小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺的平均含量分别为34.14、16.32、10.74、11.56 mg·g-1，RSD 分别为 2.1%、1.9%、2.6%、2.7%、表明该方法的重复性良好。

2.1.9 加样回收率 精密称取适量已知含量的三颗针药材粉末（40目）6份，加入一定量的“2.1.2”项下（小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺）对照品溶液各1m l，按“2.1.3”项下制备样品，测定，计算加样回收率，小檗碱、巴马汀、尖刺碱、小檗胺的加样回收率分别为100.5% 、99.8%、101.1%、102.6%，RSD分别为2.2%、1.8%、1.9%、2.4%、表明该方法的回收率良好。

2.2 校正因子的重现性考察

2.2.1 色谱柱及高效液相色谱仪考察 取“2.1.2”项下混合对照品溶液，进样 10、5、2、1、0.5 μl测定，按“ 2.1.5”项下计算小檗碱对巴马汀、尖刺碱、小檗胺的校正因子。实验考察了Thermo U3000和Agilent1 260两种高效液相色谱系统，AcclaimTM 120 C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，CAPCELL PAK C18 MG II(4.6 mm×250mm，5μm)两种色谱柱，结果见表3。

2.2.2 同一品牌仪器不同实验室的考察 对不同实验室同一品牌仪器建立的一测多评方法进行复核，仪器为Thermo U 3 000，色谱柱为 AcclaimTM 120 C18（ 4.6mm×250mm，5μm），以10、5、2、1、0.5μl进样测定个各成分相对校正因子，结果见表4。

表3 不同仪器和色谱柱测得相对校正因子

表4 不同实验室测得相对校正因子

在建立小檗碱与其余3种生物碱类成分间的相对校正因子的评价中，我们考察了不同色谱柱、液相色谱系统和实验室对校正因子的影响，结果表明，以上建立的校正因子具有较好的可信度。

2.2.3 待测组分色谱峰的定位 据文献报道,可通过保留时间差和相对保留值进行峰定位，结果见表5。据结果可知，两种定位方法的RSD≤5.0%，说明这两种方法均能准确判断巴马汀、尖刺碱、小檗胺色谱峰的位置。但因保留时间差波动较为明显，相对保留值波动较小，所以选择相对保留值来定位待测组分色谱峰。

表5 不同仪器和色谱柱测得的相对保留值

2.3 一测多评法与外标法结果比较研究

分别精密吸取供试品溶液各5μl注入高效液相色谱仪，测定。采用外标两点法和一测多评法计算三颗针药材中巴马汀、尖刺碱、小檗胺的含量，结果见表6。

由表6可知，常规的外标法实测含量值与一测多评计算含量值比较无显著性差异(RSD＜5.0%)。由此说明一测多评法可用于三颗针药材的多指标成分质量评价研究。

3 讨论

3.1 提取方法的选择

本实验选用超声、回流和回流后超声等不同提取方法，考察不同提取方法对三颗针中生物碱提取效率的影响，得出结论：水浴回流30min，再超声处理(功率250W，频率40 kHz)1h，药材中的生物碱提取效率较高。

3.2 提取溶剂的选择

本实验选用甲醇、乙醇和丙酮3种提取溶剂，以及加酸与否和加酸的比例，得出结论：用甲醇—盐酸（90∶1），药材中的生物碱提取较为完全。

表6 外标法和一测多评法（内标法）测定三颗针中生物碱含量的比较 (%，n=3)

3.3 流动相的选择

比较甲醇、水、磷酸不同用量和流动相不同pH值对盐酸小檗碱的保留时间及其相邻峰分离度的影响。结果表明乙腈-0.02mol／L磷酸二氢钾溶液(25∶75)，保留时间适当分离效果较好，与其它方法相比，该方法所采用的流动相具有简便、柱污染小、分离度好的优点。

3.4 内标物的选择

本实验选用小檗碱为内标物进行一测多评法的理由是：小檗碱不仅是三颗针中主要药效成分，而且是2010年版《中华人民共和国药典》中三颗针质量控制的指标性成分，并且其含量较高，性质稳定，价廉易得。

3.5 小结

本研究初步建立了一测多评法，通过测定12个批次三颗针中4种生物碱类成分，结果表明，一测多评法与外标法得到的含量值之间没有显著性差异（RSD＜5.0%)，说明建立的校正因子具有较好的可信度，可在对照品外缺时，通过一测多评技术实现同步测定三颗针药材中生物碱类成分的多个指标成分，为三颗针药材多指标质量控制体系提供了更加便捷、科学的检测方法。

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1671-1246（2015）15-0113-04