树莓茎叶中原花青素的提取分离效果分析

刘丽花 李学林*

（1 河南中医学院药学院，郑州 450000；2 河南中医学院第一附属医院药学部，郑州 450000）

树莓茎叶中原花青素的提取分离效果分析

刘丽花1，2李学林1，2*

（1 河南中医学院药学院，郑州 450000；2 河南中医学院第一附属医院药学部，郑州 450000）

目的 对树莓茎叶中的原花青素的提取分离方法进行分析。方法 采用乙醇溶液回流提取法和大孔吸附树脂分离纯化法分别提取树莓茎叶中的有效成分，并通过TLC法对其有效成分进行定性分析。结果 通过TLC法的显色剂显色，未在与对照品相同位置上显示相应颜色。结论 采用这种方法没有在树莓茎叶中提取出来原花青素。

树莓；原花青素；TLC；实验研究；中药化学

树莓又称木莓，又名托盘、马林、覆盆子等，蔷薇科Rosaceae植物，主要分布在北半球的寒带、温带，少数分布在热带、亚热带和南半球。我国野生资源十分丰富，大约有210种，南北各地均有分布。树莓不仅是鲜美的生食果品，又可以加工制成果酒、果酱、果汁、蜜饯等，而且还是蜜源植物和药用植物[1]。树莓中含有原花青素，是其中的主要的有效成分分，现代药理研究证明，原花青素具有抗氧化、抗腹泻、抗溃疡、抗抑郁、抗癌、抗突变、抑菌、防辐射、降血压、清除自由基及促进毛发生长等多种疗效[2]。本文以树莓加工利用过程中的废弃的茎叶为原料，鉴别并提取其中的原花青素，充分开发树莓的利用价值。

1 实验材料

1.1 仪器 ZN700真空减压浓缩罐（浙江苍南县立瓯石化设备有限公司），TO-Z-2型提取罐（浙江苍南县立瓯石化设备有限公)，300 mm不锈钢多层过滤器（浙江海宁医药器材厂），AB-8型大孔吸附树脂（天津市光复精细化工研究所），RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣仪器厂），TDL-5-A型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），SHB-B95型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），GL-200型暗箱式双光紫外仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司），CP2250型赛多利斯电子天平（德国）。

1.2 试药 树莓（河南省封丘县青堆树莓专业合作社提供），表儿茶素标准品（中国药品生物制品检定所），AB-8型大孔吸附树脂（天津市光复精细化工研究所），甲苯（洛阳昊华化学试剂有限公司），丙酮（天津市福晨化学试剂厂），冰乙酸（西安化学试剂厂），三氯化铁（天津市凯通化学试剂有限公司），铁氰化钾（北京化工厂），香草醛（北京化工厂），硅胶Gf254（上海化学试剂采购供应站），羧甲基纤维素钠（天津市福晨化学仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 树莓茎叶的提取和浓缩 取树莓的茎 (120 kg)、叶(70 kg)，除去杂质，切至2～4 cm的段或丝；加入7倍量75%乙醇，80℃加热回流提取两次，每次1.5 h，合并提取液，搅拌均匀；静置，取上清液，再减压浓缩至无醇味，取上清液即为上样液。

2.2 AB-8大孔吸附树脂预处理 在树脂柱内加入高于树脂层10～20 cm的乙醇浸泡3～4 h，然后放净洗涤液，为一次提取过程。用同样方法反复洗涤至出口洗涤液在试管中加3倍量水不显混浊为止，后用纯水充分淋洗至无明显乙醇气味，即可使用。

2.3 提取液的分离纯化 采用AB-8大孔吸附树脂分离纯化原花青素[3-4]，取上样液500 ml，以1000 ml·h-1的流速加入大孔树脂柱内；静置吸附10 h；再分别用1700 ml的水、10%乙醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇梯度洗脱，流速为600 ml·h-1，分批收集流出液，减压浓缩至干，备用。

2.4 原花青素的鉴别

2.4.1 原花青素显色特征分析 取大孔树脂纯化物，甲醇超声溶解，点样，展开剂中展开，分别于日光、254 nm波长下观察，并采用三氯化铁、溴水、三氯化铁-铁氰化钾、香草醛-盐酸、氢氧化钙溶液等显色剂显色，判断原花青素最显著的显色特征。结果见表1。

结合以上结果，三氯化铁和香草醛-盐酸两种显色剂作为备选，又因三氯化铁易配置、使用方便，故最终选择三氯化铁作为显色剂。

2.4.2 纯化物TLC鉴别 取大孔树脂纯化物，甲醇溶解，点样，采用甲苯：丙酮：冰醋酸=3∶3∶1的体系展开，用三氯化铁显色剂显色，结果见下图1，从左之右依次为水洗脱、10%乙醇洗脱、30%乙醇洗脱、50%乙醇洗脱、70%乙醇洗脱、95%乙醇洗脱、表儿茶素标准品。见图1。

图1薄层图谱显示，在树莓茎叶的大孔树脂洗脱液中未检测到原花青素。

2.4.3 提取液TLC鉴别 为了考察树莓茎叶提取液中原花青素经过树脂的纯化是否损失，对上样液及沉淀物按上述条件进行鉴别，结果见图2，从左至右依次为上样液、沉淀物、30%乙醇、50%乙醇、95%乙醇、表儿茶素标准品。见图2。

图2薄层图谱显示，在树莓茎叶的提取物中未检测到原花青素。

2.5 工艺对照试验 为了验证树莓茎叶中原花青素提取、鉴别方法的正确可靠，取含有原花青素的葡萄籽为研究对象进行对照研究。

2.5.1 葡萄籽的提取与分离纯化 取新鲜葡萄籽，水洗净，40℃下鼓风干燥至干，取干燥的葡萄籽，人工研磨粉碎至粗粉；取粗粉加入6倍量的石油醚浸泡6 h脱脂，滤过，弃去滤液；取滤渣，采用和树莓茎叶同样的提取和分离方法进行处理[5-6]。

2.5.2 TLC鉴别结果 取大孔树脂纯化物，甲醇溶解，点样，采用甲苯：丙酮：冰醋酸=3∶3∶1的体系展开，用三氯化铁显色剂显色，结果见下图3，从左至右依次为葡萄籽上样液、树莓茎叶上样液、30%乙醇树莓茎叶洗脱液、30%乙醇葡萄籽洗脱液、50%乙醇树莓茎洗脱液、50%乙醇树莓叶洗脱液、表儿茶素标准品。见图3。

按图3薄层图谱显示，在葡萄籽提取液及洗脱液中均检测到原花青素，而在树莓茎叶的提取液、大孔树脂纯化物中均未检测到原花青素。

2.6 文献记载方法对照 检索数据库，对树莓的有关文献中涉及提取分离的文章进行查阅总结，用以下方法提取。取适量树莓茎叶粉碎成粗粉，加入5倍量60%的乙醇溶液，浸泡1 h，60℃回流提取2次，每次30 min，合并提取液，静置，取上清液作为上样液，分离纯化方法不变。

2.6.1 TLC鉴别结果 取大孔树脂纯化物，甲醇溶解，点样，采用甲苯：丙酮：冰醋酸=3∶3∶1的体系展开，用三氯化铁显色剂显色，结果见下图4，从左从左至右依次为上样液、沉淀物、30%乙醇洗脱、50%乙醇洗脱、95%乙醇洗脱、表儿茶素标准品。见图4。

图4薄层结果显示采用文献记载的提取方法提取也未检测到原花青素。

3 讨论与分析

树莓中原花青素的提取率与树莓茎叶的状况和提取条件密切相关，因茎叶中的含量确实较低，茎叶的贮存、干燥、粉碎度、温度等都可能导致原花青素化学结构的变化和提取率的变化，本实验为下一步考察物理环境对树莓的影响起到抛砖引玉的效果。

提取溶剂也是影响提取率的关键因素。有文献记载原花青素在植物体内通常与蛋白质、多糖等以氢键和疏水键形式形成稳定的分子复合物，原花青素分子间也是如此，因此原花青素的提取剂，不仅要对其有很好的溶解性，而且还必须有氢键断裂作用。因此有机溶剂和水的复合体系最适合提取。

原花青素在中性条件下容易与金属离子发生络合沉淀，沉积在纤维中不利于提取，此时也必须采用酸化溶剂，一方面断裂原花青素与蛋白质、多糖及本身离子间的氢键和疏水键，另一方面断裂原花青素-金属离子络合键，提高提取率。

4 结论

通过这种方法，未在树莓茎叶中检测出来原花青素，主要原因有：树莓茎叶中原花青素含量较低，没有提取出来。原花青素在提取纯化等加工过程中遭到破坏。方法需进一步改进。本实验虽然没有取得一个鲜明的结果，但是在容易被大家忽略的药材加工废弃物中摸索寻找一种废物利用的方法，不失为一种药材可持续发展的思路。

[1]张琦，刘学，孟宪军，等.树莓叶的主要功效成分及开发利用前景[J].中国调味品，2008，2:26-29.

[2]张立实.花青素与原花青素的生物学作用研究进展[J].全国公共卫生与食物营养高层论坛.

[3]韩泽梅，李晓波，张玉平，等.树莓种子原花青素的提取分离工艺研究[J].天然产物研究与开发，2006，18:108-111.

[4]胡静.玫瑰花总原花青素的分离、纯化与分析[D].杭州：浙江大学论文2005.

[5]赵平，宋学娟，张月萍.大孔树脂对葡萄籽原花青素的吸附研究[J].中国中药杂志，2007，32（20）:2196-2201.

[6]马龙，向阳.葡萄籽中原花青素提取工艺的研究[J].新疆医科大学学报，2005，28，（3）:215-217.

Branchesand leaves of the raspberry in the extraction of proanthocyanidins Analysis on the Effect of the Extraction and Separation Method of Proanthocyanidins in Stems and Leaves of Raspberry

LIU Lihua1,LI Xuelin1,2
(1.Collegeof Pharmacy,HenanUniversityof TraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China;2.Department of Pharmacy,TheFirst AffiliatedHospitalof HenanUniversityof TraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450000,China)

Objective To analyze the extraction and separation method of the proanthocyanidins in stems and leaves of raspberry.Methods The ethanol solution reflux extraction and macroporous resin separation and purification method were used to extract the active ingredients which were qualitatively analyzed TLC method.Results Through chromogenic reagent of TLC method,the corresponding color was not displayed in the same position in the reference substance.Conclusion This method didn't extract proanthocyanidins in stems and leaves of raspberry.

raspberry;proanthocyanidins;TLC;experimental research;Chemistry of Chinese Materia Medica

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.22.080

1672-2779（2015）-22-0150-03

*通讯作者：lixuelin450000@163.com

2015-08-31）