乳状液的组成及油滴粒径对β-胡萝卜素生物接近度的影响

张金迪，樊金玲*，杨 睿，朱文学，孙晓菲

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003）

β-胡萝卜素是一种广泛存在于水果和蔬菜中的脂溶性营养成分[1]，是人体VA的主要来源，具有抗癌、预防心血管疾病等多种功能，可防止老化和衰老引起的多种退化性疾病[2-3]。β-胡萝卜素的生物利用过程包括：从食品基质中释放至消化液→在小肠内形成脂质胶束→被小肠黏膜细胞吸收→被转运至门脉及淋巴循环及在肝脏中转化为VA或被储存4个步骤[4]。在体外实验中，常用β-胡萝卜素从食品基质中释放到胃肠道随后被包被在脂质微粒中程度——即“生物接近度”来评价食物中β-胡萝卜素的生物利用率。食物中的β-胡萝卜素在人体内的利用率较低[5]，原因可能与β-胡萝卜素在食物基质中被包被、水溶性差以及化学不稳定性等有关[6]。因此，制备高生物利用率的β-胡萝卜素功能性食品和膳食补充剂具有广阔的市场前景。

采用高压均质技术制备乳状液作为β-胡萝卜素的载体，克服了其不溶于水及易被氧化等缺点，可有效提高其生物利用率[7-8]。许多因素影响乳状液中β-胡萝卜素的生物利用率，如油滴粒径、脂肪含量和性质、β-胡萝卜素浓度及乳化剂的类型等。Wang Pan[9]、Salvia-Trujillo[10]和Yi Jiang[11]等的研究表明，β-胡萝卜素的生物接近度随乳状液中油滴粒径的减小而增大。Salvia-Trujillo[12]和McClements[13]等报道了β-胡萝卜素的生物接近度随乳状液中油相含量的升高而增大；但是也有研究发现：均质处理前在胡萝卜泥中加入油脂（5%橄榄油）对β-胡萝卜素的生物接近度无显著影响[14]。Qian Cheng等[6]的研究表明载体油类型影响乳状液中β-胡萝卜素的生物接近度，油相分别为长链脂肪酸（玉米油）、中链脂肪酸（Miglyol 812）和不被消化的风味油（橙油）时，β-胡萝卜素的生物接近度逐渐降低（分别为66%、2%、0%）。Wang Pan等[9]的研究表明油相中β-胡萝卜素的含量在0.025%～0.050%范围内时，其胶束化率逐渐降低，但当β-胡萝卜素的含量继续增加时，其胶束化率没有明显变化。Liu Yuwei等[15]的研究表明不同乳化剂（司盘-20、乳清分离蛋白、可溶性大豆多糖）影响乳状液的物理性质、微观结构，进而影响β-胡萝卜素的生物接近度，其生物接近度大小顺序为：乳清分离蛋白＞司盘-20＞可溶性大豆多糖。

本实验以胶束化率为指标、采用静态体外消化法研究吐温-20作为乳化剂制备的乳状液中β-胡萝卜素的生物接近度，着重探讨β-胡萝卜素的胶束化过程、均质压力和次数、β-胡萝卜素质量分数和油相含量对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响规律及可能机制。以期为乳状液形式的β-胡萝卜素膳食补充剂和强化剂的开发和研制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全反式β-胡萝卜素（产品号：101335477，纯度≥98%）美国Sigma公司。

吐温-20（分析纯） 上海山浦化工有限公司；正己烷、丙酮、无水乙醇均为国产分析纯 天津德恩化学试剂厂；胃蛋白酶、胰酶、胆盐均为生化级 美国Sigma公司；大豆油（食品级） 中粮食品营销有限公司。

1.2 仪器与设备

GYB50-6S高压均质机 上海东华高压均质机厂；QYC-2102C恒温培养摇床 上海福玛实验设备有限公司；FA1004分析天平 上海上平仪器公司；TGL-18C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂；NPW-12水浴氮吹仪 合肥艾本科学仪器有限公司；36X生物显微镜上海巴拓仪器有限公司；PHS-3C型pH计 上海越平科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 全反式β-胡萝卜素样品定性分析

采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）对全反式β-胡萝卜素样品进行定性分析。

HPLC条件：色谱柱：YMC C30（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL；流动相A：甲醇，流动相B：甲基叔丁基醚。洗脱条件：0～10 min 50% A。检测器波长范围：190～550 nm；检测波长：450 nm。

1.3.2 β-胡萝卜素乳状液的制备

油相制备：将质量分数0.2%的β-胡萝卜素和大豆油混合，超声波处理5 min，低于50℃加热搅拌5 min，使β-胡萝卜素完全溶解于大豆油中。

水相制备：10.0 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）。

将5%（质量分数，下同）的油相、1.5%的吐温-20和93.5%的水相混合，1 000 r/min剪切5 min，高压均质机20 MPa均质1次，得到β-胡萝卜素乳状液。

为研究油相含量对β-胡萝卜素生物接近度的影响，乳状液中油相含量分别选择1%、2%、4%、5%、7%、9%、10%、12%、15%、18%、20%。为研究β-胡萝卜素浓度对生物接近度的影响，分别制备β-胡萝卜素质量分数为2、5、10、15、20、30 mg/100 g的乳状液。

1.3.3 体外消化法

该方法参考文献[16-18]并做适当修改。

胃消化法：称取5 g β-胡萝卜素乳状液置于150 mL锥形瓶中，加入10 mL电解质溶液（50 mmol/L NaCl、14 mmol/L KCl、3.5 mmol/L KH2PO4、10 mmol/L CaCl2•2H2O、3.6 mmol/L MgCl2•6H2O），1 mol/L HCl调节pH值至2.0，加入2 mL胃蛋白酶液（50.25 mg/mL，胃蛋白酶溶于0.1 mol/L HCl）保鲜膜封口放入摇床，于37℃、95 r/min消化1 h。

肠消化法：取出锥形瓶，用1 mol/L NaHCO3调节pH值至6.90±0.01，加入9 mL胆盐-胰酶液（31.13 mg/mL、5 mg/mL；胆盐、胰酶溶于0.1 mol/L NaHCO3），封口放入摇床，于37℃、95 r/min消化2 h。

1.3.4 生物接近度（胶束化率）的测定

上述消化过程结束后，于5 000×g离心10 min得到上清液，上清液过0.22 μm有机滤膜得到胶束（用于分析β-胡萝卜素可能被小肠吸收的程度——胶束化率）。

胶束中β-胡萝卜素的萃取：避光条件下，在胶束中加入等体积萃取剂，轻微振荡，静置分层；反复萃取至无色，合并萃取液；用氮吹仪吹干后复溶，待测。

β-胡萝卜素质量浓度的测定：采用紫外-可见分光光度计于450 nm波长处定量测定待测样品中β-胡萝卜素的质量浓度。通过下式计算β-胡萝卜素的胶束化率。

式中：ρ1为胶束中β-胡萝卜素的质量浓度/（μg/mL）；ρ2为乳状液中β-胡萝卜素的质量浓度/（μg/mL）；V1为胶束体积/mL；V2为乳状液体积/mL。

肠消化不同时间乳状液中β-胡萝卜素的相对胶束化率按照下式计算。

式中：B为肠消化不同时间乳状液中β-胡萝卜素的胶束化率/%；B120min为肠消化120 min时乳状液中β-胡萝卜素的胶束化率/%。

1.3.5 粒度分析

用光学显微镜（放大16×40倍）观察β-胡萝卜素乳状液以及胃消化前后、肠消化前后消化液的微观结构。显微图片由Canon IXUS 125 HS相机拍摄。油滴粒径通过图像处理软件Adobe Photoshop CS5测定[19]。油滴粒径dn由式（3）计算得出，平均粒径-d由式（4）计算得出，体积百分比由式（5）计算得出。

式中：dn’为通过显微图片测得的油滴粒径/mm；16×40为显微镜的放大倍数；1 000为μm与mm间的换算倍数。

式中：n为显微图片中油滴个数。

式中：Vn为粒径为dn油滴的体积和/μm3；V为所有油滴的总体积/μm3。

1.4 数据统计分析

所有实验重复3次。用DPS 3.01数据处理软件，对实验结果进行0.01水平上的单因素试验统计分析。

2 结果与分析

2.1 全反式β-胡萝卜素HPLC分析结果

图1为全反式β-胡萝卜素标准品的HPLC图和全波长扫描光谱图。可知本标准品不含有其他异构体。

图1 全反式β-胡萝卜素的HPLC图（450 nm）（a）及全波长扫描光谱图（b）Fig.1 HPLC chromatogram (at 450 nm) (a) and UV absorption spectrum (b) of all-trans-β-carotene

2.2 体外消化体系中β-胡萝卜素的胶束化过程

图2 乳状液中β-胡萝卜素在不同消化时间的胶束化率和相对胶束化率Fig.2 Ratio and relative ratio of β-carotene transferred from the emulsion to a micellar phase at different digestion times

图2为乳状液中β-胡萝卜素经肠消化不同时间（2、5、8、12、18、30、60、90、120 min）的胶束化率和对应得到的相对胶束化率。可知在肠消化初始阶段的0～12 min内，β-胡萝卜素的胶束化率增长很快：如肠消化2 min时，β-胡萝卜素的胶束化率和相对胶束化率分别为4.26%、47.7%；肠消化12 min时，β-胡萝卜素的胶束化率和相对胶束化率分别已经达到7.12%、79.8%；肠消化12～30 min阶段，β-胡萝卜素的胶束化率增长变缓，相对胶束化率由79.8%增加至94.4%；30 min之后无明显变化。β-胡萝卜素的胶束化过程与脂肪水解过程密切相关；脂肪在胰脂肪酶的作用下生成的脂肪酸，与胆盐等共同形成胶束，大油滴同时变成小油滴，位于油滴中的

图3 胃肠消化过程中乳状液微观结构的变化Fig.3 Microstructural changes of the emulsion during gastrointestinal digestion

β-胡萝卜素迁移至胶束中进而被吸收。实验观察了胃消化前后、肠消化前后消化液中分散相（即油滴）的微观结构变化（消化液用pH 7.0的磷酸盐缓冲液稀释5倍）。如图3所示，胃消化后部分油滴发生明显的聚集现象，Salvia-Trujillo等[10]的研究也发现了相似的现象。这一现象可能和消化液pH值的变化以及机械振荡有关。一方面，胃液的酸性环境可引起油滴的絮凝或聚结，另一方面，模拟胃消化过程中的蠕动所采用的振荡则有利于油滴的分散，油滴聚结速率和分散速率相对平衡时，乳状液中液滴的大小也相对恒定[10,20]。在肠消化阶段起始时（即肠消化前），油滴聚集现象减弱；这可能与加入胆盐-胰酶液对消化液稀释作用、溶液成分和pH值的变化有关[21]。消化液浓度的减小减弱了油滴间疏水相互作用，离子强度和pH值的变化改变了液滴之间的静电相互作用，从而破坏了油滴的聚合[10]。肠消化结束后的显微观察图中基本看不到油滴，说明大粒径油滴已经被脂肪酶水解。Amyoony[20]的研究也表明，肠消化时脂肪分解速率最快在前4 min，30 min时脂肪分解率基本达到最大值。脂肪的变化过程与本研究中β-胡萝卜素胶束化率的变化过程相吻合，从一定程度上说明了脂肪水解与β-胡萝卜素胶束化过程的相关性，而肠消化前30 min是脂肪水解和β-胡萝卜素胶束化过程的重要阶段。

2.3 均质压力和次数对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响

图4 不同均质压力对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响Fig.4 Effect of different homogenization pressures on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions

研究不同均质压力（0、10、20、30、35 MPa）对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响，结果如图4所示。β-胡萝卜素生物接近度随均质压力的升高而增大，除均质压力为20、30 MPa之间的差异不显著外，其余均达到显著水平。如未经均质处理的样品中β-胡萝卜素的胶束化率仅为0.98%，均质压力为10、20、35 MPa时，胶束化率分别增加至3.23%、8.71%和10.87%，约是未均质样品的3.3、8.9、11倍。

图5 不同均质压力下β-胡萝卜素乳状液的微观结构Fig.5 Microstructures of β-carotene emulsions homogenized at 10, 20,30 and 35 MPa

图6 不同均质压力下β-胡萝卜素乳状液的粒度分布Fig.6 Particle size distribution of β-carotene emulsions homogenized at 10, 20, 30 and 35 MPa

图5为不同均质压力下β-胡萝卜素乳状液的显微图片，图6为其对应的粒度分布情况。随着均质压力的增大，乳状液中油滴的平均粒径减小，粒径分布范围也越来越窄。如10 MPa时，乳状液中油滴粒径范围约为1.56～14.06 µm，平均粒径约为4.28 µm；均质压力为20、30、35 MPa时，乳状液中油滴粒径范围分别约为 0.39～7.81、0.16～3.91、0.16～2.34 µm，油滴平均粒径分别减小至1.60、0.86、0.44 µm，乳状液中油滴的平均粒径和胶束化率的关系如图7所示，油滴的平均粒径与胶束化率呈线性负相关，即胶束化率随油滴平均粒径的减小而增大。

图7 油滴平均粒径和胶束化率的关系Fig.7 Relationship between average oil droplet size and the ratio of β-carotene incorporated into micelles

β-胡萝卜素生物接近度的影响Fig.8 Effect of different homogenization cycles on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions图8 不同均质次数对乳状液中

研究不同均质次数（1、2、3次）对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响，结果如图8所示。随着均质次数的增加，β-胡萝卜素的胶束化率显著降低：20 MPa均质1次的胶束化率分别约为2次的1.3倍，3次的2.7倍。高压均质过程中大油滴被剪切为小油滴，一方面使脂肪与消化酶之间作用的表面积增大[13]，更多的油滴被水解为脂肪酸，从而形成更多的胶束；另一方面，由于油滴粒径的减小，也使得β-胡萝卜素从油滴中转移至胶束中的迁移半径减小，迁移阻力随之减小；β-胡萝卜素的胶束化率也因此得到提高。Wang Pan[9]和Salvia-Trujillo[10]等也报道了β-胡萝卜素的生物接近度随油滴粒径的减小而增加，这与本实验中均质压力对β-胡萝卜素生物接近度影响的研究结果一致。但是本实验同时发现，在同一均质压力条件下，增加均质次数同样可使油滴粒径减小，而β-胡萝卜素的胶束化率却意外地显著降低，说明除油滴粒径外的其他因素影响了β-胡萝卜素的胶束化率。随着均质次数增加，乳状液形成过程中分散液滴表面形成的界面膜强度的紧密程度增大[22]，β-胡萝卜素难以从油滴中释放转移至胶束中。

2.4 油相含量对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响

图9 不同油相含量乳状液的微观结构Fig.9 Microstructures of emulsions containing different oil contents

图9为不同油相含量（5%、10%、15%、20%）乳状液的显微图片（用pH 7.0的磷酸盐缓冲液稀释5倍）。随着油相含量的增加，乳状液中油滴越来越多，分布越来越密集，但油滴的平均粒径差别不大，约为1.60 µm。

β-胡萝卜素生物接近度的影响Fig.10 Effects of different oil contents on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions图10 不同油相含量对乳状液中

不同油相含量对乳状液中β-胡萝卜素的胶束化率影响如图10所示。β-胡萝卜素的胶束化率随着油相含量的增加呈“S”型增长趋势。当油相含量小于2%时，β-胡萝卜素的胶束化率增长缓慢；当油相含量为2%～18%时，β-胡萝卜素的胶束化率增长较快；而当油相含量大于18%时，β-胡萝卜素的胶束化率不再继续增长，维持在一较高的水平（42.51%）。当油相含量在一定范围内时，随着其含量增大，更多的油脂被脂肪酶消化形成脂肪酸，参与胶束的形成，因此β-胡萝卜素的胶束化率随之上升。由于消化体系中脂肪酶和胆盐的浓度是一定的，限制了其对更多脂肪水解和胶束形成的影响，因此，当油相含量增大至某一水平以上时，β-胡萝卜素的胶束化率不再随之变化，而是维持在一个较高的水平。

诸多研究者报道了油相含量对β-胡萝卜素生物接近度的影响，但结论却有较大差异。Salvia-Trujillo等[12]的研究表明乳状液中油相含量增加4倍（1%～4%）时，β-胡萝卜素的生物接近度增加了6倍（14%～84%）；Hornero-Méndez等[23]研究也发现添加5%的油可以提高类胡萝卜素的胶束化率。但Svelander[24]的研究表明油的存在和类胡萝卜素的生物接近度没有明显的相关性；Knockaert等[14]的研究发现，均质处理前在胡萝卜泥中加入油脂（5%橄榄油）对β-胡萝卜素的生物接近度无显著影响。本实验结果则表明油相含量对β-胡萝卜素生物接近度的影响与油相含量的范围有关。如实验所获得的“S”型曲线的前段和后段，即油相含量较低（1%～2%）或较高（18%～20%）时，对β-胡萝卜素生物接近度影响不显著，而在“S”型曲线的中段，β-胡萝卜素生物接近度随油相含量的增加而显著增大。这一结果部分解释了前人研究结论在表面上相互矛盾的原因。

2.5 乳状液中β-胡萝卜素质量分数对其生物接近度的影响

图11 β-胡萝卜素质量分数对乳状液中β-胡萝卜素生物接近度的影响Fig.1 Effect of β-carotene concentration on the bioaccessibility of β-carotene incorporated in emulsions

研究乳状液中β-胡萝卜素质量分数对其生物接近度的影响，结果如图11所示。随着乳状液中β-胡萝卜素质量分数的升高，其胶束化率先上升后下降，而胶束中β-胡萝卜素的绝对质量则呈先上升而后进入平台期的变化趋势。由于体系中油相和胆盐含量是一定的，形成胶束的最大能力也是一定的，从而使胶束包被β-胡萝卜素的能力也相应地存在一个饱和值。β-胡萝卜素在消化液中可能以4种形式存在：包被于胶束中、溶于油滴、附于可溶性聚合物中或呈不溶状态[25]。本实验发现，消化液经离心后的沉淀部分有些是橘黄色，部分油相被水解成脂肪酸，溶于其中的β-胡萝卜素在消化液中呈不溶状态，经离心沉淀出来。

3 结 论

在一定范围内，β-胡萝卜素的胶束化率与乳状液中油滴平均粒径线性负相关；β-胡萝卜素的生物接近度随油相含量增加而增加，达到一定值时趋于饱和；乳状液中β-胡萝卜素的胶束化率随其质量分数的增加先上升后降低，而胶束中β-胡萝卜素的绝对质量则呈先上升而后进入平台期的变化趋势。

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