烯虫酯的纯化

欧阳逊，刘松梁，姚明明，曾 洁，张广吉

(中国桂林昊旺生物科技有限公司科研中心，广西 桂林 541000)

安全、低毒、低残留、高效、方便和经济等是农药生产的基本原则，这些原则是农药和农业发展的基本要求，也是当今人们对环境友好生产的诉求[1]，满足这些要求当推生物农药。ZR-型保幼激素即是一种典型生物农药，不仅是一种具备保幼激素活性的高效昆虫生长调节剂，而且生物活性和稳定性都远远超过天然保幼激素[2-4]。其中ZR-515是广西昊旺生物科技有限公司主打产品，于2014年12月建成投产，实现了国内首家工业化规模生产保幼激素类似物烯虫酯（11-甲氧基-3,7,11-三甲基-2E，4E-十二烯酸异丙酯）。

作为农药原药，投放市场前须办理农药登记，办理农药登记需提供一定数量高纯的烯虫酯（＞98%），以及原药中存在的杂质成分确认。目前车间生产的烯虫酯含量在92%左右，仅在合格范围内，与高纯原药含量有较大差距，需通过一定手段纯化方能取得。

鉴于烯虫酯性黏，饱和蒸气压低，同时对温度敏感，不宜用蒸馏除去可能存在的杂质；同时可能存在的杂质分子量与烯虫酯分子量比较接近，也不适合分子蒸馏法提纯；比较可行的纯化方法有高效液相制备及提纯。但据相关单位信息，提纯100g费用4～5万，是一笔不小的费用。本公司科研中心实验室通过一段时间摸索，采用柱层析方法进行分离提纯，制得高纯烯虫酯。

1 仪器和试剂

福立气相色谱仪（9790Ⅱ），岛津液相色谱仪，玻璃层析柱（30mm×400mm），柱层析硅胶（0.038～0.049mm），三用紫外分析仪，硅胶板（50mm×100mm），旋转蒸发仪。

正己烷（95%），丙酮（AR），癸二酸二丁酯（GD），甲醇（GR），烯虫酸标准样品（＞99%），烯虫酯（87% ～93%）。

2 烯虫酯的含量测定分析

烯虫酯含量测定普遍使用气相色谱和高效液相色谱分析[5-6]，本研究采用气相色谱与液相色谱结合分析烯虫酯含量[7]。

2.1 气相色谱分析

2.1.1 仪器

气相色谱仪：氢火焰离子化检测器，气相工作站。色谱柱：OV-1701，30m×0.32mm×0.5μm毛细管柱。微量进样器：10μL。

2.1.2 气相色谱条件

温度：柱室240℃，汽化室270℃，检测室270℃。

气体流量：载气 (N2) 30 mL∙min-1，H230mL·min-1，Air 300 mL·min-1。

进样量：1.0μL；保留时间：烯虫酯约5.2min，内标物约6.3min，参见图1。

2.1.3 测定步骤

2.1.3.1 标准溶液的配制

图1 内标法测定烯虫酯出峰情况

称取烯虫酯标准样一定量（精确至 0.0002g），置于10mL容量瓶中，准确加入2.0mL内标物（癸二酸二丁酯），用丙酮溶解并稀释至刻度，摇匀，备用。

2.1.3.2 试样溶液的配制

称取烯虫酯与标准样相同的量（精确至0.0002g），按2.1.3.1同法操作。

2.1.3.3 测定

分别取标准样溶液进样3次和试样溶液进样2次测定。

2.1.3.4 计算

由测得的3次标准样烯虫酯与内标物峰面积之比计算平均值，同时测2次试样烯虫酯与内标物峰面积之比，计算平均值，按下式计算烯虫酯含量X。

式中：r1为标准样烯虫酯与内标物峰面积之比算平均值；r2为试样烯虫酯与内标物峰面积之比算平均值； m1为标准样烯虫酯质量；m2为试样烯虫酯质量； w1为标准样烯虫酯质量分数。

平行测定2次试样，结果允许误差不大于1.5%。

2.2 高效液相色谱分析

2.2.1 仪器

色谱柱：C18，5μm，150mm×4.6mm；流动相：流速 1.0mL·min-1， V甲醇/V水= 85/15；检测波长：270nm；柱温：35℃ ；进样量： 4.6μL。

2.2.2 测定步骤

取一定量标准样烯虫酯溶解于100mL容量瓶中，从中取5mL用甲醇稀释到50mL，同法配制试样烯虫酯溶液。在相同条件下各平行进样2次，测得标准样积分面积A标样和试样的积分面积A试样，取平均值。

2.2.3 计算

式中：A试样为试样的面积；A标样为标准样的面积；m试样为试样的质量，g；m标样为标准样的质量，g；p为标准样的含量，%；n为试样溶液的稀释倍数与标准样溶液的稀释倍数比。

平行2次测得结果面积的绝对误差小于0.5%.

3 烯虫酯的定性分析

高效液相色谱对烯虫酯检测的灵敏性可用于其定性分析，分析操作可按照2.2的步骤进行，从而可判断烯虫酯可能存在的杂质个数，具体见图2、图3、图4。

图2 烯虫酯标样液相图谱

图3 纯化烯虫酯（99.22%）图谱

图4 烯虫酯原样（88%）图谱

从以上3个图谱可看出，经纯化后烯虫酯3.605min处的杂质基本去除，9.322min的杂质去除，12.279min处和1.756min处的杂质仍然存在（参见图3），但含量变少。

4 烯虫酯的纯化

鉴于烯虫酯作原药登记需提供一定量的高纯烯虫酯，而且还可部分用于企业内部用作参考标样，因此有必要摸清烯虫酯的纯化处理条件。鉴于烯虫酯黏性大，饱和蒸气压低，仅通过分相、水洗和减压蒸馏不能去除杂质，需另辟途径方可实现纯化，于是采用了柱层析纯化。

4.1 硅胶板层析实验

为了摸准洗脱条件，用硅胶板做层析实验，使Rf差值在0.2左右，从而分离烯虫酯中杂质。经试验，分别以正己烷与丙酮、乙酸乙酯与丙酮混合液作流动相，烯虫酯原样、杂质Rf情况见图4～图8（图中A为烯虫酯、B、C为杂质）。

图4 正己烷∶丙酮100∶0.8烯虫酯原样的薄层层析图

图5 正己烷∶丙酮100∶1烯虫酯原样的薄层层析图

图6 正己烷∶丙酮100∶1.2烯虫酯原样的薄层层析图

图7 乙酸乙酯∶丙酮100∶0.8烯虫酯原样的薄层层析图

图8 乙酸乙酯∶丙酮100∶1烯虫酯原样的薄层层析图

当用乙酸乙酯和丙酮作溶剂时，烯虫酯、杂质A、B都接近溶剂线，不能分离，而极性最大的杂质已离开点样线(见图7、图8)。最后以V正/V丙：100/1～100/2正己烷丙酮混合液作洗脱液。

4.2 柱层析

层析柱：30mm×400mm；层析硅胶：0.038～0.049mm；硅胶装填高度：27～30cm； 上样量：4～6g；流动相：正己烷丙酮混合液；检测：三用紫外分析仪。

4.2.1 定性分析

收集不同洗脱段的烯虫酯溶液，经旋转蒸发仪减压脱除溶剂后，洗脱液前段、中后段的硅胶板层析图见图9。

图9 烯虫酯原样、层析前段和中后段的薄层层析情况

结果表明，宜采集洗脱中后段浓缩液，并用液相对洗脱液中段的浓缩液进行定性分析，结果见图3、4及表1。发现经纯化后，个别杂质峰已消失，部分杂质峰明显减少，达到纯化效果。

表1 烯虫酯纯化前后杂质峰变化情况

4.2.2 定量分析

浓缩液经旋转蒸发仪减压脱除溶剂后，对收集的中后段烯虫酯用气相色谱作定量分析，结果见表2。说明柱层析可纯化烯虫酯，得到高纯度的烯虫酯，并且发现与烯虫酯原样浓度关系不大。

表2 烯虫酯纯化前后的含量

5 潜在的经济效益

根据目前的分离技术，使用比较先进的高效液相色谱制备机纯化烯虫酯，费用4～5万元·(100g)-1，处理耗费色谱纯溶剂500L·(100g)-1左右，溶剂的后续处理将是一笔不小的费用。使用柱层析分离提纯，柱层析纯化成本1.6万元·(100g)-1。主要溶剂正己烷可部分回收，如提纯的烯虫酯能部分转化为产品，产生的效益参见表3。由表3可见，实验室用柱层析法分离提纯烯虫酯是一种可行、实用、见效快的方法。

表3 柱层析纯化烯虫酯费用核算

[1] 黎金嘉.农药液体制剂配方设计参考[J].农药市场信息，2007(13)：4-6.

[2] 金人宪，杨育华.ZR-型保幼激素类似物合成工艺研究[J].现代农药，2007(1)：15-17．

[3] Amanda S.Hill,Joanne V.Mei,Chih-MingYin, Bruce S, et al.Determination of the Insect Growth Regulator Methoprone in Wheat Grain and Milling Fractions Using an Enzyme immunoassay[J]. Agric.Food chem., 1991(39): 1882-1886.

[4] Joanne V. Mei, Chih-Ming Yin, Louis A, Corpino, et al.Hapten Synthesis and Development of immunoassays for Methoprene[J]. Agric. Food chem., 1991(39): 2083-2090.

[5] Robert A. Heckman, Bruce S. Ferguson, Titan S. Fan, et al. Validation of an Enzyme immunoassays for analysis of Metfhoprene Reidues on Tobacco[J]. Agric. Food chem.,1992(40): 2530-2532.