蓝莓发酵酒澄清和冷稳定处理的响应面优化

李亚辉，马艳弘，黄开红，张宏志，刘 晨，乔月芳

（江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）

蓝莓发酵酒澄清和冷稳定处理的响应面优化

李亚辉，马艳弘*，黄开红，张宏志，刘 晨，乔月芳

（江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014）

研究了蓝莓发酵酒的澄清和稳定处理方法。以澄清度和色度为指标，利用响应面法对蓝莓酒澄清稳定处理条件进行了优化。结果显示，最佳处理条件为：皂土添加量0.80 mg/mL、澄清时间8 d、冷处理时间6 d，在此条件下处理后蓝莓酒的澄清度和色度分别为0.749和1.128。与没经过处理、只进行了澄清处理或冷处理的样品相比，利用优化条件处理的蓝莓酒具有较好的澄清度，无潜在的蛋白破败和色素沉淀，且在长时间瓶储中具有良好的澄清度和色度稳定性。此研究为蓝莓酒的工业化生产提供了一定的理论依据和技术支持。

蓝莓；发酵酒；澄清；稳定；响应面法

蓝莓（Blueberry），又称越桔、蓝浆果等，是杜鹃花科（Ericaceae）越桔属（Vaccinium spp.）多年生落叶或常绿灌木[1]。蓝莓属小浆果类果树，世界上约有450多个品种，中国约有91个种28个变种，主要分布于东北和西南地区，兔眼蓝莓在我国南方地区有一定的栽培面积[2-4]。蓝莓果实酸甜可口、营养物质丰富，富含有机酸、维生素、矿物质、不饱和脂肪酸和微量元素等，尤其是花色苷含量较为丰富[5-7]。

蓝莓酒是以蓝莓为原料的生物发酵制品，其最大限度地保留了蓝莓果实中的营养成分和保健功能因子，长期饮用具有美容养颜、降低血脂、延缓衰老、增强免疫力、防治癌症等功效[8-10]。目前蓝莓酒酿造过程中还存在很多问题，其中化学性浑浊沉淀是最常见的问题。化学性浑浊沉淀是指经过澄清处理后的澄清酒体重新变浑浊或产生沉淀，是果酒的一种病害，严重影响着果酒的品质及商品形象[11-12]。澄清稳定处理是果酒后处理中的重要步骤，也是解决果酒浑浊沉淀的主要方法。果酒澄清稳定的处理方法主要有下胶、离心、过滤、冷处理、热处理和添加稳定剂等[13-16]。本研究通过对蓝莓酒澄清和稳定处理条件的优化，以期找到一种合理有效的澄清稳定处理方法，使蓝莓酒保持较好澄清度和色度，为蓝莓酒的工业化生产提供一定的理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓酒（兔眼蓝莓酿造，12.6%vol）：江苏省农业科学院农产品加工研究所酿制；皂土、硅藻土：上海杰兔工贸有限公司。

1.2 仪器与设备

UV.1600PC型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；FYL-YS-258控温冰箱：北京福意联电器有限公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；ZNCL-GS数显加热磁力搅拌器：上海越众仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓酒澄清和冷稳定处理的操作流程及操作要点

澄清剂配制→澄清处理→冷稳定处理→硅藻土过滤

澄清稳定处理操作要点

（1）澄清剂的配制：皂土溶液的制备参照王英等所述方法[17]，称取10 g皂土，加入100 mL蒸馏水在50℃水浴中软化，浸泡24 h，用磁力搅拌器搅拌成均匀浆体。

（2）澄清处理：取一定量浸泡好的皂土在搅拌状态下加入到蓝莓酒中，使其混合均匀后静置。

（3）冷稳定处理：将经澄清处理的蓝莓酒放入控温冰箱，使其温度降至-5℃，并在此温度下保持一段时间，然后用硅藻土过滤除去沉淀物。将经澄清和冷稳定处理的蓝莓酒在常温下放置2个月后摇匀测定其澄清度和色度。

1.3.2 澄清度和色度测定

澄清度的测定参照徐春等[18]所述方法：以蒸馏水作为参比，测定样品在波长680 nm处的吸光度值表示澄清度。

色度的测定参照梁冬梅等[19]所述方法：将蓝莓酒稀释5倍，以蒸馏水为参比，测定样品在波长420 nm、520 nm和620 nm处的吸光度值，以三者吸光度值之和表示色度。

1.3.3 单因素试验

按照1.3.1所述澄清稳定处理方法，分别研究了皂土使用量（0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL）、澄清时间（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）和冷处理时间（2 d、4 d、6 d、8 d、10 d、12 d）对蓝莓酒澄清度和色度的影响。每个单因素试验平行重复3次，结果取平均值。

1.3.4 响应面试验设计

在单因素试验结果基础上，采用Box-Behnken设计，以皂土用量、澄清时间和冷处理时间3个因素为自变量，进行响应面分析，以-1，0，+1分别代表自变量的低、中、高3个水平，试验因素及水平设计见表1。

1.3.5 稳定性试验

稳定性检验：参照文献[20-21]中所述澄清度稳定性检验方法对样品进行稳定性检验，主要对其铜、铁、蛋白质、色素和酒石酸稳定性进行检验。

瓶储检验：将样品装瓶、打塞、常温下避光放置，分别在2、4、6、8、10和12个月后摇匀、取样，测定其澄清度和色度。每个样品3个重复，取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 皂土添加量对蓝莓酒澄清稳定处理后澄清度和色度

的影响

由图1可知，随着皂土添加量的增加，澄清度逐渐升高，色度随着皂土添加量的增加逐渐降低，添加量＞0.8 mg/mL时澄清度变化较小，色度下降较快。说明皂土添加量对蓝莓酒澄清度和色度都有较大影响，综合考虑澄清度和色度，初步选择皂土添加量为0.8 mg/mL。

2.1.2 皂土澄清时间对蓝莓酒澄清稳定处理后澄清度和色度的影响

由图2可知，随着澄清时间的延长，澄清度逐渐升高，当澄清时间＞8 d时澄清度变化较小；色度随着澄清时间的延长逐渐降低，8 d内色度下降较快，超过8 d时色度变化较小，初步选择澄清时间为8 d。

2.1.3 冷处理时间对蓝莓酒澄清稳定处理后澄清度和色度的影响

冷处理时间对蓝莓酒澄清稳定处理后澄清度和色度的影响见图3。由图3可知，随着冷处理时间的延长，澄清度逐渐升高，当冷处理时间＞6 d时澄清度变化较小；色度随着冷处理时间的延长有下降的趋势，但变化较小，初步选择冷处理时间为6 d。

2.2 响应面法优化试验结果

2.2.1 回归模型的建立及显著性检验

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken试验设计，以皂土添加量（x1）、澄清时间（x2）和冷处理时间（x3）为自变量，以澄清度（y1）和色度（y2）为响应值，对蓝莓酒澄清稳定处理工艺进行优化，响应面试验设计及结果见表2，对回归模型的方差分析见表3。

利用Design-Expert软件对表2中试验数据进行二次多项回归拟合，获得澄清度（y1）和色度（y2）的二次多项回归模拟方程如下：

由表3可知，皂土添加量对澄清度和色度均具有极显著影响；澄清时间对色度具有极显著影响，而对澄清度影响较小；冷处理时间对澄清度具有极显著影响，对色度有显著影响。这说明皂土添加量和冷处理时间是澄清度的主要影响因素，澄清时间对其影响较小；皂土添加量和澄清时间是色度的主要影响因素，冷处理时间影响较小。两个响应值所得模型均极显著，且失拟项在P=0.05水平上均不显著；两个模型的校正决定系数R2Adj分别为0.923 9和0.908 9，表明这两个模型的拟合度较好，分别能够解释92.39%和90.89%响应值的变化，说明这两个模型能够很好地预测澄清稳定条件对澄清度和色度的影响。同时这两个模型均具有较低的离散系数（coefficient of variance，CV）值，分别为0.78% 和1.30%，说明整个试验具有较好的精确度和可靠性。

2.2.2 响应面分析及优化

以澄清度为指标的响应面结果如图4所示。由图4可知，任何两个交互因素的响应面都存在最高点，皂土量对澄清度的影响比较明显，皂土量和澄清时间的交互作用也较明显。

以色度为指标的响应面结果如图5所示（因澄清时间和冷处理时间交互作用对色度影响不明显，响应面不存在最高点，故没有显示此图）。由图5可以看出，交互因素的响应面均存在最高点，皂土量对色度的影响较为明显，其他两个因素影响不明显。

通过Design-Expert软件分析优化得到，获得最大澄清度和最高色度时的澄清稳定处理条件为皂土添加量0.80 mg/mL、澄清时间7.81 d、冷处理时间6.29 d，在此条件下蓝莓酒澄清度和色度的预测值分别为0.758和1.139。为了验证回归方程的可行性，对所得最佳条件进行了优化和验证试验。在皂土量、澄清时间和冷处理时间分别为0.80 mg/mL、8 d和6 d下进行3次平行试验，所得澄清度和色度值分别为0.749±0.009和1.128±0.011，与预测值的相对误差分别为1.19%和0.97%，说明优化结果可靠。

2.3 稳定性试验结果

2.3.1 稳定性检验

按照优化条件对蓝莓酒进行澄清稳定处理后，对其进行澄清度稳定性检验，结果如表4所示。其中，对照1没有进行澄清和稳定处理；对照2只进行了澄清处理；对照3只进行了冷处理。对照1结果说明，没有进行处理的蓝莓酒具有潜在的蛋白破败和色素沉淀；对照2结果说明，利用皂土进行澄清处理可除去潜在的蛋白破败和部分潜在的色素沉淀；对照3结果说明，冷处理可减弱潜在的蛋白破败和除去部分潜在的色素沉淀。澄清稳定处理样品结果说明，澄清处理和冷处理结合可完全除去潜在的蛋白破败和色素沉淀，可使其具有良好的澄清度稳定性。

2.3.2 瓶储检验

对样品和对照进行瓶储试验，以进一步检验其稳定性，结果如图6所示。图6A显示了瓶储中蓝莓酒澄清度的变化，没有进行处理的蓝莓酒（对照1）瓶储2个月后澄清度开始下降；只进行澄清处理的蓝莓酒（对照2）瓶储8个月后澄清度开始下降；只进行冷处理的蓝莓酒（对照3）瓶储4个月后澄清度开始下降；利用优化条件处理的蓝莓酒样有较高澄清度且在瓶储12个月内仍保持较好澄清度。图6B显示了瓶储中蓝莓酒色度的变化，3个对照随着瓶储时间的延长色度都逐渐升高，这可能是因为其澄清度下降，在波长420 nm、520 nm和620 nm处OD值升高造成的；经优化条件处理的蓝莓酒样的色度在瓶储12个月内较为稳定，几乎没有变化。

3 结论

以澄清度和色度为指标，利用响应面试验对蓝莓酒澄清稳定处理条件进行了优化。最佳处理条件为皂土添加量0.80 mg/mL、澄清时间8 d、冷处理时间6 d，在此条件下，蓝莓酒的澄清度和色度分别为0.749和1.128。利用此条件处理的蓝莓酒具有较好的澄清度、无潜在的蛋白破败和色素沉淀，且在长时间瓶储中具有良好的澄清度和色度稳定性。

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Optimization of clarification and cold treatment for blueberry wine using response surface methodology

LIYahui,MAYanhong*,HUANG Kaihong,ZHANG Hongzhi,LIUChen,QIAOYuefang

(Institute of Farm Product Processing,Jiangsu Academy of AgriculturalSciences,Nanjing 210014,China)

The technology for blueberry wine clarification and stabilization was studied.Using clarity and chroma as index,the clarification and stabilization condition of blueberry wine were optimized using response surface methodology.Results showed thatthe optimum conditions for clarification and stabilization were bentonite addition 0.80 mg/mL,clarification time 8 d and cold treatment time 6 d.Under such conditions,the final clarity and chroma of blueberry wine were 0.749 and 1.128,respectively.The wine treated with the optimum method showed higher clarity compared with the wine without treatment or only with clarification or cold treatment,and it showed no potential protein and pigment precipitate.The blueberry wine afteroptimum treatmentshowed high clarity and chroma stability in a long-term bottle storage.This study provided a theoreticalbasis and technicalsupportforthe industrialproduction of blueberry wine.

blueberry;brewed wine;clarification;stabilization;response surface methodology

S567.2

A

0254-5071（2015）02-0126-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.028

2014-12-16

江苏省农业科学院博士后基金（6511307）；江苏省自然科学基金（BK2012786）

李亚辉（1985-），男，助理研究员，博士，研究方向为食品发酵与生物技术。

*通讯作者：马艳弘（1972-），女，副研究员，博士，研究方向为食品发酵与生物技术。