米曲霉机理性探索对酱油生产的启示

赵国忠，姚云平，唐晓姝，郝光飞，王春玲，侯丽华，陈 卫*

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.天津科技大学 食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457）

米曲霉机理性探索对酱油生产的启示

赵国忠1，姚云平1，唐晓姝1，郝光飞1，王春玲2，侯丽华2，陈 卫1*

（1.江南大学 食品学院，江苏 无锡 214122；2.天津科技大学 食品营养与安全教育部重点实验室，天津 300457）

将相同培养条件下的不同米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株之间进行了比较基因组学和蛋白质组学的研究，分析酱油发酵过程中米曲霉的关键基因和蛋白对酱油风味产生的影响。通过米曲霉沪酿3.042（中国）和米曲霉RIB40（日本）菌株的基因组学比较，发现与酱油风味物质形成相关的特异基因。围绕米曲霉3.042及其诱变菌株米曲霉100-8的蛋白质组学比较，找到米曲霉代谢过程中与风味物质形成有关的蛋白，为酱油工艺的改进提供了理论基础。

米曲霉；酱油；比较基因组学；蛋白质组学

米曲霉（Aspergillus oryzae）是酱油制曲环节的主要菌株，因其在大曲发酵阶段能产生丰富的酶类物质分解原料，对酱油风味的形成具有至关重要的作用。在中国，酱油酿造一般使用米曲霉沪酿3.042，而日本则多采用米曲霉和酱油曲霉混合菌种发酵。为获得性状优良的菌株，诱发突变或自发突变选育菌种被广为使用。米曲霉100-8即是采用N+离子注入米曲霉沪酿3.042诱变所得，该突变株分泌偏酸性蛋白酶多，代谢速度快，符合工业化大生产的需要。2005年，日本米曲霉菌株RIB40全基因组序列得到破译，但是应用基因组学对米曲霉在酱油发酵技术改进的研究却未见报道。本文希望通过对米曲霉菌株的比较基因组学研究和蛋白质组研究，发现对酱油发酵风味有益的内在关系，改善我国的酿造酱油风味。

1 米曲霉基因组学比较

米曲霉沪酿3.042和米曲霉RIB40的基本特征如染色体大小、GC含量（鸟嘌呤（Guanine）和胞嘧啶（Cytosine）所占的比率）、开放阅读框（open reading frame，ORF）数量及tRNA基因数量等，归类结果如表1所示。通过MAUVE（版本2.3.1）全基因组比较后，发现米曲霉沪酿3.042和米曲霉RIB40菌株之间有很多的同源区域块如图1所示，有颜色的框代表的是在两个菌中描述一致的线性区域（locally collinear blocks，LCBs）。该区域边缘由于重组、插入或倒转导致，因而产生了不同的contig。连接LCBs的垂线指示了染色体区域间的相似性，图1上面的数字代表了核苷酸的位置信息。

由图1可知，米曲霉沪酿3.042和米曲霉RIB40的蛋白质序列BLASTP比对（标准的蛋白序列与蛋白序列之间的比对）（相似度＞50%），结果显示，它们有超过1 100个直系同源蛋白编码基因（双向比对），其余为各自特异基因，其中，一些特异基因与酱油发酵的风味形成有重要关系。

在前期米曲霉发酵酿造酱油过程中，米曲霉分泌大量胞外酶，比如蛋白酶和淀粉酶等。同时也产生了很多化合物，包括酯、醇、酸、醛、酮、酚、杂环分子、炔烃和苯[2]。然后，发酵大曲用盐水混匀进入了后期厌氧发酵阶段。其他酯类是无氧代谢的次级代谢产物，这些就组成了风味物质的最主要，也是最重要的成分。由于酯类物质能产生挥发性芳香类风味，所以它们在酱油发酵中的作用尤为重要。酯类可以通过不同种类醇和羧酸或者活性脂酰辅酶A （coenzyme，CoA）分子的催化作用在胞内形成[3]。CoA有关的酶类氧化脂肪酸生成酰基CoA然后催化生成酯类，醋酸酯类就是由乙醇和脂酰辅酶A为底物合成的。乙醇脱氢酶催化醛变为醇。米曲霉沪酿3.042菌株中的特异性酯酶（Ao3042_06598）既水解也可以合成酯键。同时，在米曲霉沪酿3.042菌株中特异性醛/酮还原酶（Ao3042_05141）能够催化醛类的减少和酮转变为醇[4]。在发酵过程中，水解酶可以分解原料为小分子物质，蛋白质和多肽可以水解成氨基酸和小肽。在酱油发酵过程中，微生物通过分解氨基酸或肽类化合物可以使风味物质得到平衡。米曲霉沪酿3.042特异基因中发现的D-氨基酰化酶（Ao3042_01621）一直被工业中用来生产D-氨基酸[5]。

米曲霉RIB40中的硒代半胱氨酸裂解酶（AO090120000084）可以专一地将硒代半胱氨酸分解成丙氨酸。米曲霉RIB40的丝氨酸O-乙酰转移酶（AO090012000151）是半胱氨酸生物合成的重要酶类。此外，RIB40特异基因中的3-羟基苯甲酸氧合酶（3-hydroxyanthranilate oxygenase，HAAO）（AO090102000066）参与色氨酸新陈代谢，预苯酸脱水酶（AO090009000693）和苏氨酸合酶（AO090038000224）也分别参与苯基丙氨酸和苏氨酸的新陈代谢[6]。

2 米曲霉蛋白质组学比较

通过对米曲霉沪酿3.042和米曲霉100-8的二维凝胶图蛋白质点的比较，经过一级质谱验证以后，一共确认了522个蛋白点。其中有288个蛋白点在米曲霉100-8中有较高的表达丰度，而有163个蛋白点的表达丰度较低[7]。进一步的分析发现，有184个蛋白点只在米曲霉100-8中表达，这些点在米曲霉沪酿3.042中没有表达。而有66个蛋白点只在米曲霉沪酿3.042中表达，在米曲霉100-8中没有表达。碳代谢中包括糖酵解和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循环途径，其中米曲霉100-8有91个相关点表达量较高，36个相关点表达量下降。而在氮代谢的氨基酸代谢和合成途径中，米曲霉100-8有43个点表达量升高，10个点下降[7]。

分析发现这些变化的点大多与酱油风味的产生有关，并且能解释米曲霉100-8产酱油风味更好的原因。如两个菌株在氨基酸合成和TCA循环中蛋白表达的差异可能会促进氨基酸和有机酸彼此之间的转化，而这个改变肯定会导致发酵风味的差异。图2是根据蛋白质组学比较结果绘制的碳代谢和氨基酸合成相关的中心代谢通路图（反应相关酶见参考文献[7]）。如图2中蛋白质点的变化情况用颜色标出，红色代表米曲霉100-8中表达上升的点，绿色代表表达下降的点，增加或降低的蛋白点的强度由颜色的深浅来表示。

氨基酸生物合成相关的酶如表2所示。由表2可知，芳香类氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸），支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）和含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）为产风味成分的主要氨基酸，在米曲霉100-8的氨基酸合成过程中，这些氨基酸合成相关的酶类表达量都有不同程度的升高（表达蛋白点标注参见参考文献[7]）。

戊抗真菌素芳香类多肽（点155）的作用是可以催化莽草酸（shikimate）途径中的芳香类酶[8]，风味氨基酸可以由shikimate途径合成。点104是芳香类氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）生物合成途径的第一步反应所需的酶，在这里米曲霉100-8中该酶的表达量也大大升高。二羟酸脱水酶（点116）和酮醇酸还原异构酶（点128）是支链氨基酸生物合成途径中的关键酶。3-异丙基苹果酸脱氢酶（点105）在甲硫氨酸链的延伸和亮氨酸合成过程中起重要的作用，并且该酶还催化3-异丙基苹果酸到α-酮异己酸的氧化脱羧反应[9]。高丝氨酸脱氢酶（点126和127），高半胱氨酸合酶（点115）和单独的维生素B12甲硫氨酸合酶（点115、137、484、135、136、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147）催化甲硫氨酸合成过程中的反应。三磷酸甘油酸脱氢酶（点165）在米曲霉100-8中的表达也是下降的，可能是被丝氨酸的变构效应所抑制[10]。酵母氨酸脱氢酶（点131和132）在米曲霉100-8中的表达也降低了，从而减少了酵母氨酸产生L-赖氨酸的能力[11]。

芳香类氨基酸，支链氨基酸和含硫氨基酸等风味氨基酸在生物体内是伴随着分解代谢不断进行的，氨基酸的分解代谢生成了更多种类的风味物质，如氨基酸的转氨基作用等。通过米曲霉蛋白质组学，发现在米曲霉100-8中也有不同氨基酸的代谢途径部分酶表达水平的升高。在酪氨酸代谢途径中，4-羟苯基丙酮酸双加氧酶（4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase，HPPD）（点106和107）催化4-羟苯基丙酮酸为风味产物2,5-二羟苯乙酸（高龙胆酸盐）[14]。这个酶也同时参与苯丙氨酸的代谢过程。缬氨酸代谢过程中，甲基丙二酸盐半醛脱氢酶（点156）催化甲基丙二酸半醛转变为丙酰辅酶A。甘氨酸脱氢酶（点123）是甘氨酸分裂系统的一部分，甘氨酸羟甲基转移酶（点124和125）通过甲基化或脱甲基作用实现甘氨酸和丝氨酸之间的相互转变。谷氨酸/亮氨酸/苯丙氨酸/缬氨酸脱氢酶（valine dehydrogenase，VDH）（点117、118、119和120）在谷氨酸合成过程中起重要的作用。它的前体物质是α-酮戊二酸，在转氨基过程中可以作为氨基接受体，是氨基酸转变为风味物质的第一个限速反应[15]。转氨基作用反应完以后，由相应的醛作用反应分解α-酮酸。

维生素B1生物合成酶在风味物质的形成过程中很重要。美拉德反应中，半胱氨酸和维生素B1可以产生类似肉的风味[16]。本实验中，米曲霉100-8有两个点（点495和496）明显升高，而且是升高倍数最多的，这两个点的表达分别升高7.6倍和8.1倍。米曲霉100-8中维生素B1生物合成蛋白表达量的增加会升高酱油中维生素B1的含量，带来风味成分上的改变。

3 结束语

酱油的发酵过程是非常复杂的，尤其是米曲霉的参与过程。在米曲霉的参与阶段，原料首先受到它所分泌的酶的水解作用。其次，米曲霉利用原料进行生命代谢活动，其代谢物分泌到体外，有的代谢物质在一定的环境条件下再次发生反应，这些即构成了酱油的风味物质成分。

通过对米曲霉沪酿3.042和米曲霉RIB40菌株特异基因的比较可知，米曲霉沪酿3.042和米曲霉RIB40在发酵过程中对不同类型氨基酸的代谢量不一样。由醇和氨基酸反应生成的酯类物质也会有差别。由不同特异基因所编码产生的醇、氨基酸、酯类化合物的不同比例必然会导致其所发酵出的酱油风味的差异。蛋白质组学研究发现，表达量变化的蛋白参与了糖酵解，TCA循环，氨基酸生物合成和二次代谢等重要途径。

米曲霉基因组测序和凝胶蛋白质组图谱的建立为更多更好的研究真菌其他未知领域提供必要的条件。同时，本文对酱油发酵工艺提供了一定的研究基础，为改进我国的酱油酿造工业做出了贡献。

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Exploring the mechanism ofAspergillus oryzae for soy sauce fermentation

ZHAOGuozhong1,YAO Yunping1,TANG Xiaoshu1,HAO Guangfei1,WANGChunling2,HOU Lihua2,CHENWei1*

(1.School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety, Tianjin University of Science&Technology,Tianjin 300457,China)

Different Aspergillus oryzae underthe same culture condition was researched by comparative genomes and proteomics in soy sauce fermentation.The genomes of A.oryzae 3.042(China)and A.oryzae RIB40(Japan)were compared,and some specific genes which may be related to the flavor of soy sauce were found.Then,the proteomics of A.oryzae 3.042 and the mutantstrain A.oryzae 100-8 were compared,and the important proteins in metabolic processes were selected.These studies provided a theoreticalbasis for soy sauce fermentation.

Aspergillus oryzae;soy sauce;comparative genomes;proteomics

TS255.54

A

0254-5071（2015）02-0104-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.024

2014-11-24

第55批中国博士后科学基金面上资助（2014M551503）

赵国忠（1983-），男，副教授，博士，研究方向为食品微生物学。

*通讯作者：陈 卫（1966-），男，教授，博士，研究方向为功能性微生物学。