黑曲霉G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

孙海彦，黎娟华，刘恩世，易小平，杨景豪，尹一伊，彭 明

（中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

黑曲霉G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆与序列分析

孙海彦，黎娟华，刘恩世，易小平，杨景豪，尹一伊，彭 明*

（中国热带农业科学院 热带生物技术研究所，海南 海口 571101）

从黑曲霉Aspergillus niger G-1125克隆到了生淀粉糖化酶菌基因的DNA及cDNA序列。序列分析表明，该生淀粉糖化酶基因组DNA序列编码区长2 172 bp，cDNA编码区长1 923 bp，该基因含有4个内含子，共编码640个氨基酸，前18个氨基酸为信号肽序列，该氨基酸序列中共含有2个潜在的糖基化位点，软件预测出该酶的分子质量约为68 ku，等电点为pH值4.07。

黑曲霉；生淀粉糖化酶；克隆；序列分析

淀粉酶是催化淀粉中糖苷键水解的酶类的总称，是酿造工业中一种重要的酶类，生淀粉糖化酶（raw starch digesting glucoamylase，RSDG）是指在低于淀粉糊化温度条件下，直接水解不经过蒸煮糊化的生淀粉颗粒，从非还原性末端的α-1,4或α-1,6糖苷键释放出葡萄糖的一种酶[1]。由于用生淀粉糖化酶可以直接分解淀粉生成葡萄糖，从而省去传统工艺中的高温处理工序，能节约大量能源。所以从节约能源的角度考虑，研究和开发生淀粉糖化酶具有重要的意义[2]。

由于生淀粉酶具有良好的应用前景，近年来引起了国内外研究者的广泛兴趣，在该研究领域做了很多工作。但是主要集中在生淀粉酶高产菌的选育、产酶培养基和发酵条件的优化、酶的纯化和性质研究、酶的应用研究等[3-10]。随着基因工程的发展，通过基因克隆及分子改造进行定向育种成为微生物菌种选育中的一种重要技术手段，但是目前有关生淀粉基因的克隆主要集中在生淀粉α-淀粉酶的克隆方面[11-13]，有关生淀粉糖化酶的基因克隆方面的研究还比较少，在前期中选育到一株生淀粉糖化酶高产菌黑曲霉（Aspergillus niger）G-1125，该菌种在淀粉培养基上产生淀粉糖化酶的活力可以达到458 U/mL，该活力远远高于相关文献报道的生淀粉糖化酶的活力，如罗时等[14]报道的马铃薯生淀粉糖化酶产生菌所产酶的酶活为100 U/mL，孙子羽等[15]报道的化气单胞菌所产生淀粉糖化酶活力最高是98.42 U/mL，本研究从前期实验中选育到一株生淀粉糖化酶高产菌黑曲霉Aspergillus niger G-1125，研究克隆了该菌所产生淀粉酶糖化酶的编码基因，并对基因序列进行了分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑曲霉Aspergillus niger G-1125菌种：由本实验室保藏。pMD 18-Tvector载体，Top10、Taq（聚合）酶、T4DNA连接酶、DNAMarker、三磷酸脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleoside-5′-triphosphate，dNTPs）、10×PCRBuffer：日本TaKaRa公司；DNA、RNA提取及反转录试剂盒：天根生化科技（北京）有限公司；胶回收试剂盒：美国Omega公司。

1.2 仪器与设备

D-6708PCR仪：日本TaKaRa公司；5804R离心机：德国Eppendorf公司；NANODROP2000紫外分光光度计：美国Thermo公司；DYY-8C型电泳仪：北京六一仪器厂；76S/07859凝胶成像分析仪：美国Bio-Rad公司。

1.3 试验方法

1.3.1 Aspergillus niger G-1125 RSDG基因的克隆

引物设计：应用Vector.NTI.Advance.v10.3软件设计一对特异性引物，上游引物P1：5′-ATGTCGTTCCGATCTCTACTCGCC-3′；下游引物P2：5′-GGTGACTGACACCTGGCGGTAG-3′；由上海生物工程有限公司合成。

DNA克隆：以提取的Aspergillus niger G-1125基因组DNA为模板，用合成的引物进行PCR扩增，PCR反应体系：Taq 酶0.5μL；10×PCR Buffer 5μL；dNTP 4μL，引物20 pmol；模板2.5μL，无菌水37μL。反应程序：94℃预变性3 min；94℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸2 min，退火温度为58℃，25个循环；最后72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。

cDNA的克隆：以提取的菌体总RNA为模板，反转录合成cDNA第一链，反应条件为42℃、60 min，70℃、15 min。然后以反转录合成的cDNA第一链为模板，采用DNA克隆相同的方法克隆基因的cDNA。

基因的鉴定：将回收纯化的PCR产物连接到pMD18-T vector载体上，并转化大肠杆菌Top10菌株的感受态细胞，然后送测序。

1.3.2 基因的序列分析

采用ncbi、DNAstar、signalp 4.1 server、http：//www.cbs. dtu.dk/services/NetNGlyc/等数据库和软件，分析RSDG基因的同源性、内含子、推导蛋白的氨基酸序列，并对编码蛋白的等电点、信号肽、糖基化位点等性质进行预测。

2 结果与分析

2.1 Aspergillus niger G-1125生淀粉糖化酶基因的克隆

Aspergillus niger G-1125的基因组DNA和RNA的提取结果见图1。

由图1可以看出，条带1是提取的总RNA，两条带亮度一致，说明提取的总RNA质量很好，可以用于后续反转录和基因克隆实验，条带2的DNA带没有弥散带，说明提取的DNA质量也很好，可以用于后续实验。

分别以基因组DNA及总RNA反转录产物为模板的目标基因克隆结果见图2。

由图2可知，由基因组DNA为模板到的目标基因片段即DNA片段和由反转录产物为模板的目标基因的cDNA片段，均为单一条带，亮度较高，这说明已经成功克隆到了相应的目标片段，可以用于连接pMD18-T vector载体，转化大肠杆菌Top10并送测序，此外由图2还可以得出，目标基因的DNA和cDNA片段大小都约为2 000 bp。

2.2 序列分析

分别以Aspergillus niger G-1125基因组DNA和总RNA反转录产物为模板，克隆到目标基因的片段进行测序分析，发现该该基因的DNA序列开放阅读框长度为2 172 bp，cDNA开放阅读框大小长1 923 bp（含终止子）。经过序列比对发现，该基因含有4个内含子，如图3中方框所示，位置分别是216～290 bp、578～632 bp、729～790 bp、1 429～1 486 bp。鸟嘌呤（Guanine）+胞嘧啶（Cytosime）含量为56.22%，NCBI搜索比对后发现，该基因与Aspergillus niger糖化酶基因同源性达到99%，与Aspergillus awamori糖化酶基因同源性达到99%，与Aspergillus shirousami糖化酶基因同源性达到91%。推导氨基酸序列用DNAstar软件处理得出，详细序列见图4。由图4可知，该基因编码的酶蛋白由640个氨基酸组成。软件预测出该酶的分子质量约为68 ku，等电点为4.07，两个潜在的糖基化位点是N195 NQTG和N206 NGSS，采用signalp 4.1 server在线分析发现，该酶蛋白含有一个18个氨基酸组成的信号肽序（MSFRSLLALSGLVCTGLA），属于GS15亚家族。

3 结论

本研究通过提取生淀粉糖化酶菌种Aspergillus niger G-1125基因组DNA和总RNA，并对总RNA进行反转录，克隆到了该菌生淀粉糖化酶基因的DNA及cDNA序列。经测序后分析发现，该菌种的生淀粉糖化酶DNA序列长2 172 bp，cDNA序列长1 923 bp，通过DNA和cDNA序列的比对后发现，该基因含有4个内含子，编码的酶蛋白由640个氨基酸组成，其中前18个氨基酸为信号肽序列，属于GS15亚家族。该研究为今后构建高产的生淀粉糖化酶的基因工程菌奠定了实验基础。

[1]SUN H Y,ZHAO P J,GE X Y,et al.Recent advances in microbial raw starch degrading enzymes[J].Appl Biochem Biotechnol,2010,160(4): 988-1003.

[2]ROBERTSON G H,WONG D WS,LEE C C,etal.Native or raw starch digestion:a key step in energy efficient biorefining of grain[J].J Agric Food Chem,2006,54(2):353-365.

[3]ANDERS V N,CARSTEN A,TINE H,et al.Development of new α-amylases for raw starch hydrolysis[J].Biocatal Biotransfor,2006,24 (1-2):121-127.

[4]EZEJI T C,BAHL H.Production of raw-starch-hydrolysingα-amylase from the newly isolated Geobacillus thermodenitrificans HRO10[J]. World J Microbiol Biotechnol,2007,23(9):1311-1315.

[5]DEMIRKAN E S,MIKAMI B,ADACHI M,et al.α-Amylase from B.amyloliquefaciens:purification,characterization,raw starch degradation and expression in E.coli[J].Process Biochem,2005,40(8):2629-2636.

[6]KANEKO T,OHNO T,OHISA N.Purification and characterization of a thermostable raw starch digesting amylase from a Streptomyces sp.isolated in a milling factory[J].Biosci Biotechnol Biochem,2005,69(6): 1073-1081.

[7]LI H,CHI Z,DUAN X,et al.Glucoamylase production by the marine yeast Aureobasidium pullulans N13d and hydrolysis of potato starch granules by the enzyme[J].Process Biochem,2007,42(3):462-465.

[8]GAWANDE B N,GOEL A,PATKAR A Y,et al.Purification and properties of a novel raw starch degrading cyclomaltodextrin glucanotransferase from Bacillus firmus[J].Appl Microbiol Biotechnol,1999,51(4): 504-509.

[9]ITKOR P,TSUKAGOSHI N,UDAKA S.Nucleotide sequence of the raw-starch-digesting amylase gene from Bacillus sp.B1018 and its strong homology to the cyclodextrin glucanotransferase genes[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,166(2):630-636.

[10]HASHIMOTO Y,NISHIYAMA M,LKEHATA O,et al.Cloning and characterization of an amidase gene from Rhodococcus species N-774 and its expression in Escherichia coli[J].Biochimica et biophysica Acta,1991,1088(2):225-233.

[11]JEANG C L,CHEN L S,CHEN MY,etal.Cloning of a gene encoding raw-starch-digesting amylase from a Cytophaga sp.and its expression in Escherichia coli[J].Appl Envir Microbiol,2002,68(7):3651-3654.

[12]HMIDET N,BAYOUDH A,BERRIN J G,et al.Purification and biochemical characterization of a novelα-amylase from Bacillus licheniformis NH1:cloning,nucleotide sequence and expression of amyN gene in Escherichia coli[J].Process Biochem,2008,43(5):499-510.

[13]KIM C H,SATA H,TANIGUCHIH,et al.Cloning and expression of raw-starch-digestingα-amylase gene from Bacillus circulans F-2 in Escherichia coli[J].Biochimica et Biophysica Acta,1990,1048(2-3): 223-230.

[14]罗 时，谭兴和，苏小军，等.马铃薯生淀粉糖化酶高产菌株的筛选与诱变研究[J].中国酿造，2009，28（2）：19-22.

[15]孙子羽，迟乃玉，李 兵，等.响应面法优化产低温生淀粉糖化酶发酵培养基[J].中国酿造，2010，29（7）：110-114.

Cloning and sequence analysis of gene encoded raw-starch-digesting-glucoamylase from Aspergillus niger G-1125

SUN Haiyan,LIJuanhua,LIU Enshi,YIXiaoping,YANG Jinghao,YIN Yiyi,PENGMing*

(Institute of TropicalBioscience and Biotechnology,Chinese Academy of TropicalAgricultural Sciences,Haikou 571101,China)

DNA and cDNA ofraw-starch-digesting-glucoamylase were cloned from Aspergillus niger G-1125.The sequence analysis revealed thatthe length of DNA and cDNA of this gene were 2 172 bp and 123 bp,respectively.The DNA sequence contained 4 introns and encoded a protein of 640 amino acids with a signalpeptide of 18 amino acids and two potentialglycosylation sites.The calculated molecular weight and isoelectric pointof the enzyme were 68 ku and pH 4.07,respectively.

Aspergillus niger;raw-starch-digesting-glucoamylase;cloning;sequence analysis

Q933

A

0254-5071（2015）02-0051-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.02.012

2015-01-08

国家自然科学基金（31000029）；国家高技术研究发展计划“863计划”（2012AA101204）；海南省自然科学基金（ZDFD 20120765）；海南省研究生创新科研课题（Hyb2011-4）；海南省引进集成应用专项（YJJC2011004）；海南省重大科技项目（ZDZX2013023-1）；中国热带农业科学院中央级公益院所基本科研业务费专项（ITBB2015RC06）

孙海彦（1979-），女，副研究员，硕士，研究方向为微生物学。

*通讯作者：彭 明（1956-），男，研究员，博士，研究方向为生物技术。