Nrf2—ARE通路在帕金森病大鼠黑质中的表达改变

苏军红　祁秀峰　申向辉　赵丽香　胡彦峰　王伟

[摘要] 目的 观察由鱼藤酮制备的帕金森病（PD）大鼠模型黑质多巴胺能神经元中氧化应激参数、转录因子NF-E2相关因子（Nrf2）及其基因产物血红素氧合酶1（HO-1）和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1（NQO1）的表达变化情况。 方法 将健康成年雄性Wistar大鼠40只随机分为对照组和实验组，20只对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油[1 mL/（kg·d）]，20只实验组大鼠，按照2.0 mg/（kg·d）背部皮下注射鱼藤酮（鱼藤酮溶解在葵花籽油中）制备PD大鼠模型，共30 d。最后一次注射结束后实验大鼠迅速断头取材，采用分光光度法检测大鼠脑内纹状体中丙二醛（MDA）和还原型谷胱甘肽（GSH）含量变化，采用Western blot检测两组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达。 结果 对照组和实验组脑内纹状体中MDA含量分别为（6.51±1.45）、（18.13±2.14）nmol/mgprot，与对照组比较，实验组大鼠纹状体中MDA升高了64.09%（P < 0.01）。对照组和实验组纹脑内状体中GSH含量分别为（44.53±4.71）、（26.41±2.52）mg/gprot，与对照组比较，实验组大鼠纹状体中GSH降低了40.69%（P < 0.01）。对照组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin免疫印迹条带相对吸光度比值分别为（0.81±0.05）、（0.84±0.07）和（0.91±0.15），实验组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1与β-actin免疫印迹条带相对吸光度比值分别为（0.42±0.06）、（0.49±0.03）和（0.33±0.04）。与对照组比较，实验组大鼠黑质神经元中Nrf2、HO-1和NQO1表达分别降低了48.15%、41.67%和63.74%（P < 0.01）。 结论 氧化应激在PD发病中起着非常重要的作用，内源性抗氧化损伤通路Nrf2-ARE与PD的发病关系密切，可能是PD新的治疗靶点。

[关键词] 帕金森病；氧化应激；转录因子NF-E2相关因子-抗氧化反应元件；血红素氧合酶1；依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1

[中图分类号] R742.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）12（b）-0008-04

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人群中较为常见的中枢神经系统变性疾病，其主要的特征性病理变化是中脑黑质多巴胺能神经元变性坏死及Lewy小体形成，导致脑内多巴胺神经递质含量减少，主要临床症状为运动障碍，表现为静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓等。既往研究结果表明，许多慢性疾病都与人体内发生氧化应激导致体内累积过多的氧自由基有关，氧自由基在PD中脑黑质多巴胺能神经元死亡过程中起着非常至关重要的作用，抗氧化治疗PD已成为新疗法中的重要研究方向[1-2]。

转录因子NF-E2相关因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）是细胞氧化应激反应中的关键因子，通过与抗氧化反应元件（antioxidant response element，ARE）相互作用调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达。Nrf2是机体调节抗氧化反应的重要转录因子，正常情况位于细胞浆中，在细胞浆中与Keapl结合形成复合体，且被泛素蛋白酶迅速降解，从而保持其低活性的生理状态。当机体受到氧自由基和内源性毒素等攻击后Nrf2与Keapl解离，其半衰期明显延长，然后转位进入细胞核，与抗氧化反应元件ARE结合后诱导抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表达。Nrf2-ARE通路是目前发现的最为重要的内源性抗氧化损伤通路之一。

血红素氧合酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和依赖还原型辅酶/Ⅱ醌氧化还原酶1[NAD（P）H：quinone oxidoreductase-1，NQO1]是Nrf2-ARE通路编码的内源性保护基因，在抗氧化损伤方面起着重要作用。在中枢神经系统上调HO-1和NQO1的表达，能够减少氧自由基和内源性毒素对神经元的毒性作用。既往研究证实，激活Nrf2-ARE信号通路上调其基因产物的表达对神经系统疾病如癫痫、脑出血、脑梗死和脑外伤等，具有很强的神经保护功能[2]。但是，Nrf2-ARE信号通路在PD发病中表达改变还未见明确相关报道。本研究利用鱼藤酮制备PD大鼠模型，观察大鼠脑内黑质中Nrf2及其基因产物HO-1和NQO1的表达改变。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组和动物模型的制备

雄性Witstar大鼠40只，体重250～300 g，由河北医科大学实验动物中心提供。将40只Witstar大鼠随机分为对照组和实验组；20只对照组大鼠给予背部皮下注射葵花油1 mL/（kg·d），20只实验组大鼠，按照2.0 mg/（kg·d）背部皮下注射鱼藤酮（鱼藤酮溶解在葵花籽油中，充分震荡混匀后4℃避光保存），共30 d。大鼠饲养于昼夜交替的环境中，期间自由进食进水。

1.2 实验动物脑内纹状体中氧化应激参数丙二醛（MDA）和谷胱甘肽（GSH）含量测定

最后1次药物注射结束后24 h，大鼠直接断头取脑，在冰盘上迅速分离纹状体，4℃生理盐水冲洗血液，液氮速冻，于-80℃低温冰箱保存用于测量氧化应激参数（MDA和GSH）。具体实验方法按所购试剂盒说明书进行。

1.3 Western blott检测两组大鼠中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达

最后1次药物注射结束后24 h，大鼠直接断头取脑，在冰盘上迅速分离黑质所在脑块，4℃生理盐水冲洗血液，入液氮速冻后置-80℃低温冰箱保存备用。取所需脑组织入4℃裂解液匀浆5 min，冰浴静置1 h，4℃ 2000 r/min离心5 min，取上清，Bradford法测定蛋白浓度。相关样品取50 μg总蛋白经10% SDS-PAGE凝胶电泳分离，电转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉室温封闭2 h后，依照实验目的分别加入5%脱脂奶粉稀释的兔Nrf2、HO-1和NQO1单克隆抗体（1∶1000），4℃过夜。PVDF膜以TTBS洗3次。山羊抗兔IgG 荧光抗体（1∶10000，Rocland公司）室温避光1 h，漂洗5次，远红外荧光扫描成像系统（Odyssey公司） 扫描并测定目标蛋白单位光密度值，与β-actin（1∶5000，Santa Cruz）比值后，做统计学分析。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

与对照组相比，实验组大鼠毛色变黄、变脏，体态呈弓背状，行为上表现为主动活动减少、动作迟缓、步态不稳、行走时多向一侧旋转。两组在第10、13、15、19 d时各死亡1只大鼠。

2.2 实验大鼠纹状体中氧化应激参数的改变

实验组脑内纹状体中MDA含量与对照组比较，实验组大鼠纹状体中MDA升高了64.09%（P < 0.01）。实验组纹脑内状体中GSH含量与对照组比较，实验组大鼠纹状体中GSH降低了40.69%，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。

2.3 Nrf2、HO-1和NQO1在实验大鼠黑质中的表达

与对照组比较，实验组大鼠黑质神经元中Nrf2、HO-1和NQO1表达分别降低了48.15%、41.67%和63.74%，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见表2、图1。

3 讨论

PD是中老年人群中比较常见的神经系统变性疾病，其主要的病理改变是中脑黑质内多巴胺能神经元渐进性受损，导致脑内多巴胺神经递质含量减少，从而出现一系列以运动障碍为主要表现的临床综合征。基础医学和生命科学领域近年的研究结果表明，许多慢性疾病都与人体内累积过多的自由基有关，PD与自由基及氧化应激之间的关系日益成为人们研究的热点。目前大量的研究证实氧化应激产生的氧自由基损伤为PD发病的重要病理机制[3-4]。机体生理状态下，体内自由基的产生和清除处于平衡状态，当这种平衡被打破，自由基蓄积过多，就会导致氧化损伤，即所谓氧化应激。氧化损伤使脂质、蛋白质和DNA过氧化，最终导致细胞死亡[5-6]。众所周知，中枢神经系统含有丰富的脂质成分，耗氧量最高且抗氧化酶相对缺乏，所以对自由基损伤特别敏感[7]。综上所述，本研究组有理由认为抗氧化、清除氧自由基的治疗方法能为PD的药物治疗提供新的靶点。

鱼藤酮是来源于自然界中某些植物根茎的天然杀虫剂，近年被广泛应用于果蔬和池塘杀虫等农业生产。最近研究发现，鱼藤酮对中脑黑质多巴胺能神经元具有明显的神经毒性作用[8]，大鼠长期接触鱼藤酮可出现PD样症状及帕金森病理性改变[9]。本次实验结果发现鱼藤酮处理后实验大鼠出现毛色变脏、自主活动减少、弓背屈曲姿势、行走时向一侧旋转等PD样症状，前期的研究已经证实，大鼠脑内黑质多巴胺能神经元数量明显较少[10]。进一步研究发现，实验大鼠脑内纹状体中脂质代谢产物MDA含量明显增高，自由基清除剂GSH含量明显降低，表明大鼠脑内氧化平衡被破坏，发生了氧化应激损伤。

Nrf2是细胞氧化应激反应中的关键因子，在氧化应激状态下，转录因子Nrf2从细胞质转移入细胞核，与ARE结合调节抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶的表达，从而增强细胞对氧化应激的抵抗能力，即Nrf2-ARE通路在这些机体防御机制中起着非常重要的作用[11-12]。Nrf2-ARE通路在抗感染、抗凋亡、抗肿瘤、抗动脉粥样硬化、抗缺血再灌注损伤、肺纤维化和神经保护等方面发挥着广泛的细胞保护功能。到目前为止，已证实经Nrf2-ARE信号路径调节的可编码内源性保护基因超过200个[13-14]。这些保护性基因包括抗氧化蛋白类基因、Ⅱ相解毒酶基因、分子伴侣类和抗炎因子类基因等。他们在增强组织抗氧化能力、保护组织免受毒物损伤、抗肿瘤、抗感染、抗凋亡中起着重要的作用。其中Nrf2-ARE通路的基因产物HO-1和NQO1在神经保护方面的作用尤其重要。近年研究证实，在脊髓侧索硬化、癫痫、脑梗死、脑出血等神经系统疾病中上调Nrf2、HO-1或者NQO1的表达能起到神经保护作用[15-17]，但是在PD大鼠模型中Nrf2、HO-1和NQO1的表达改变还未见明确报道。

综上所述，本研究证实，在PD大鼠模型脑内氧化平衡状态被破坏，脂质代谢产物MDA生成增加，自由基清除剂GSH含量减少。同时发现中脑黑质中Nrf2、HO-1和NQO1的表达明显降低，这表明该抗氧化防御体系受到破坏，这可能是加重黑质多巴胺能神经元损伤的原因之一。Nrf2-ARE通路与PD的发病密切相关，激活该通路，诱导其基因产物的表达能够保护中脑黑质多巴胺能神经元，从而延缓PD的病情进展，后期将会进一步研究证实该推断。

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（收稿日期：2014-09-12 本文编辑：任 念）