两种基因型番茄对镉胁迫响应差异

赵首萍, 张永志, 张 棋, 王钢军, 叶雪珠

(浙江省食品安全重点实验室, 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021)

两种基因型番茄对镉胁迫响应差异

赵首萍, 张永志, 张 棋, 王钢军, 叶雪珠*

(浙江省食品安全重点实验室, 浙江省农业科学院农产品质量标准研究所, 杭州 310021)

【目的】使用两个番茄品种YSL189高镉积累和HZ903低Cd积累进行苗期水培实验，旨在揭示番茄品种间Cd耐性差异的机理, 为分子育种改良番茄重金属耐性提供新的信息。【方法】本研究以前期鉴定的番茄高Cd积累品种YSL189和低Cd积累品种HZ903为材料, 采用苗期人工气候箱水培的方式, 分析了在Cd 50和100 μmol/L胁迫下, 供试品种间形态学指标、抗氧化酶活性、Cd积累量及相关基因表达的差异, 同时分析了供试品种苗期对离子态Cd的吸收速率差异。【结果】 1)在Cd 50和100 μmol/L胁迫下, 根长对Cd胁迫最敏感, 株高和生物量次之；与低Cd积累品种HZ903相比, 高Cd积累品种YSL189表现出生物量大、根系短、株高较高的特点。2)在50和100 μmol/L Cd胁迫下, 植株Cd积累量以根>茎>叶的趋势递减；同等胁迫下, YSL189植株根、茎、叶部的Cd积累量都显著高于HZ903。3)当培养介质中Cd浓度大于20 μmol/L时, YSL189根系对离子态Cd的吸收速率显著高于HZ903； 定量PCR结果显示, 在50和100 μmol/L Cd胁迫下, 品种间Nramp2、Nramp3和ZIP的表达量差异趋势与Cd积累的差异趋势一致, 即YSL189根系Cd吸收相关基因Nramp2,Nramp3 和ZIP的表达量高于HZ903。4)在Cd 50和100 μmol/L胁迫下, 根、茎部的SOD(超氧化物歧化酶)、POD(过氧化物酶)和CAT(过氧化氢酶)活性都是YSL189高于HZ903, 同时YSL189叶部POD和SOD活性也显著高于HZ903, 同时, TBARS(巴比妥酸反应底物)含量所指示的根、茎部膜质过氧化伤害程度则没有品种间差异。【结论】YSL189根系对离子态Cd的高吸收速率以及Nramp2、Nramp3和ZIP基因的高表达量, 可能是其获得高镉积累量的原因之一；同等胁迫条件下, YSL189植株体内高Cd浓度诱导了抗氧化酶的高活性, 这说明YSL189植株对活性氧的清除能力强于HZ903。

镉； 番茄； 吸收转运； 抗氧化酶； 基因型差异

镉(Cd) 因其高毒性而被认为是典型的环境污染物[1], 自然和人为因素都可以导致土壤中的Cd浓度增加[2], 微量Cd通过食物链进入人体即可通过生物放大和积累效应对人体产生一系列损伤, 如“骨痛病”等[2]。Cd干扰植物正常代谢及细胞间活动, 尽管有些超积累植物的叶片可以耐受Cd高达100 μg/g左右[4], 但研究发现, 植株叶片Cd浓度在5～10 μg/g时就已经产生毒害作用[5]。在形态上, Cd可导致植株叶片萎黄、坏死, 根系变短、变棕色等[6-7], 生理上可导致ROS(活性氧)的大量产生, 使膜质受到过氧化的胁迫, 产生高浓度的TBARS(巴比妥酸反应底物), 导致离子渗漏等[7-8]。Cd在植物体内还可以取代必需金属离子, 导致生物大分子的结构及活性发生变化[9]。植物对重金属胁迫的耐受机制也是多样的, 如金属离子的区室化作用、离子外排、螯合作用、抗氧化酶对活性氧的清除能力及相关抗氧化物质的防卫保护作用等[9]。大量研究都证实了超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)在植物耐Cd胁迫中起到重要的作用[9-11]。Cd可以Cd2+的形式通过离子通道蛋白ZIP(ZRT, IRT like proteins)和Nramp(Natural resistance associated macrophage proteins)进入植物体内[4,12-14]。对拟南芥的研究表明,ZIP和Nramp家族基因参与植物体内Cu、Zn和Cd等金属离子的运输过程[15-16], 而各种转运蛋白间的平衡是决定植物重金属耐性的重要因素之一[9]。

尽管前人在植物对重金属胁迫响应方面已有很深入的研究, 但对于不同基因型品种间的重金属胁迫及耐性差异少有报道。本研究组前期获得了两个Cd积累量存在显著差异的番茄品种: 高Cd积累品种“YSL189”和低Cd积累品种“HZ903”。为了分析这两个品种间对重金属胁迫的响应差异, 本研究分析了Cd胁迫下, 这两个品种间Cd吸收系统及防卫系统相关参数的差异, 旨在揭示番茄品种间Cd耐性差异的机理, 为分子育种改良番茄重金属耐性提供新的信息。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为本研究室前期通过温室盆栽及实验室水培鉴定得到的番茄(LycopersiconesculentumMill) 高Cd积累品种‘YSL189’和低Cd积累品种‘HZ903’。

1.2 试验方法

1.2.1 种子萌发及处理培养方法 采用人工气候箱内水培的方法研究。番茄种子用1% NaClO 浸泡表面消毒30 min, 28℃黑暗浸种24 h。石英砂育苗, 1/2浓度的Hoagland营养液进行预培养, 苗龄15天时改为完全Hoagland营养液培养, 同时进行Cd 0、 50、 100 μmol/L的处理, 重金属Cd以CdCl2·2.5H2O形式提供, 为保证重金属浓度, 每24 h换营养液一次, 置于人工气候箱内培养。每个处理3次重复, 培养温度 28±2℃, 相对湿度75%, 光照 20000 lux, 昼夜循环, 光照14 h/黑暗10 h。

1.2.2 取样及各指标测定方法 苗龄25天时, 取各处理幼苗, 分为根、茎和叶三部分。一部分样品液氮速冻后, -80℃冰箱保存, 以备基因表达量测定用；一部分样品液氮速冻后, -40℃冰箱保存, 以备SOD、POD、CAT和TBARS测定用；一部分4℃冰箱保存, 以备Cd含量测定用。同时测定各处理番茄幼苗的根长、株高及生物量。

取-40℃保存的样品, CAT活性、SOD活性、POD活性测定参照Shah等[17]的方法, TBARS含量测定参考张志良等[18]的方法。取-80℃保存的样品, 用异硫氰酸胍法提取RNA, 用powerscriptTM逆转录酶逆转录为cDNA。以该cDNA为模板分析基因表达量的变化。按照NCBI/GenBank 提供的序列设计适合荧光定量PCR的引物(表1), 以GAPDH为参照。引物由上海博亚生物技术有限公司合成,纯度大于99%；TaqTM, MgCl2和dNTP由宝(TaKaRa)生物工程(大连)有限公司提供。

1.2.3 植株Cd吸收速率测定 预培养15天的番茄幼苗, 再以完全Hoagland营养液培养10天, 选取长势一致的番茄幼苗, 分别置于50 mL以0.2 mmol/L CaSO4为溶剂配成的含Cd 5、10 、20、50、100、200 μmol/L(以CdCl2·2.5H2O形式加入)的溶液中, 迅速称取培养液及幼苗的总量(M1), 按上述条件培养5 h后再次称取称量培养液及幼苗的总量(M2), 同时测定溶液Cd浓度(C2)及幼苗根重(M3), 按照下面公式计算吸收速率:

V[μmol/(g·h), FW]={C1×50-C2×[50-(M1-M2)]}×10-3/(5×M3),

其中,V表示吸收速率；C1表示溶液初始Cd浓度(μmol/L)；M1、M2、M3单位为g；50表示吸收液体积(mL)。

1.2.4 数据分析 数据用计算机软件Microsoft Excel及SPSS11.5进行统计分析, 方差分析利用SPSS11.5软件, 采用Duncan法分析。

2 结果与分析

2.1 形态学特性及镉积累量差异

Cd处理显著降低供试番茄品种的株高、根长及生物量(表2)。根长表现最为明显, 与对照相比, 50 μmol/L Cd处理显著降低了‘HZ903’和‘YSL189’的根长, 但Cd 50 μmol/L与100 μmol/L处理间没有显著差异；Cd胁迫对株高的影响与根长稍有不同, Cd 50 μmol/L的处理与对照及100 μmol/L 处理间都没有显著差异, 而与对照相比, Cd 100 μmol/L处理则显著降低供试品种的株高。可见与株高相比, 根长对Cd胁迫更为敏感。Cd胁迫对总生物量的影响存在品种间的差异, 与对照相比‘YSL189’在Cd 50 μmol/L处理时总生物量显著降低, 而‘HZ903’在Cd 100 μmol/L处理时总生物量显著降低, 说明从生物量的角度来看, 高Cd积累品种‘YSL189’要比低Cd积累品种‘HZ903’对Cd胁迫更敏感。

表2数据同时可以看出, ‘YSL189’的株高和总生物量大于‘HZ903’, 而根长则小于‘HZ903’, 且这一趋势不随Cd处理浓度的变化而变化, 即供试两个不同Cd积累特性的番茄品种间, 高Cd积累品种‘YSL189’与低Cd积累品种‘HZ903’相比, 具有生物量大、根系短、株高较高的特点。

注(Note): 表中数据为三次重复的平均值±SE Values are means±SE(n=3); 同列数据后不同字母表示处理间在0.05水平差异显著Values followed by different letters within a column are significantly different among treatments at the 0.05 level.

由表3可知，与对照相比, Cd处理显著增加供试品种植株各部位的Cd积累量, 但Cd 50和100 μmol/L处理间植株各部位Cd积累量则没有显著差异, 且这一规律不存在品种间差异。供试品种植株不同部位的Cd积累差异趋势一致, 即根>茎>叶,且不同植株部位间Cd积累量差异达到显著水平(P<0.05), 这说明根部是最易积累Cd的部位。从品种间Cd积累量差异来看, 不同Cd浓度处理条件下,‘ YSL189’的植株各部位Cd积累量都显著高于‘HZ903’的相应部位Cd积累量, 而且这一趋势不随Cd处理浓度的变化而变化(表3)。

注(Note): 表中数据为三次重复的平均值±SE Values are means±SE(n=3); 同列数据后不同字母表示处理间在0.05水平差异显著Values followed by different letters within a column are significantly different among treatments at the 0.05 level.

2.2 品种间镉吸收及相关基因表达差异

供试品种根系对离子态Cd的吸收速率也存在显著差异(图1), 尤其是培养介质中Cd离子浓度达到20 μmol/L以上时, 高Cd积累品种‘YSL189’根系对Cd离子吸收速率显著高于低Cd积累品种‘HZ903’, 且品种间差异随着培养液中Cd离子浓度的增加而增加。但是培养介质中Cd离子浓度为低于20 μmol/L时, 两个品种根系对Cd离子吸收速率没有显著差异。

[注(Note): 图中数据为三次重复的平均值,误差线代表标准偏差SE Values are means±SE(n=3), the short line on the curve means SE.]

定量PCR结果说明, Cd吸收转运基因可能在品种间Cd积累量基因型差异上起到重要作用(图2)。Nramp、ZIP和IRT基因在高Cd积累品种‘以色列189’和低Cd积累品种‘合作903’中的表达方式有差异。在Cd 50和500 μmol/L处理下, 品种间Nramp2、Nramp3和ZIP的表达量差异趋势与与Cd积累的差异趋势一致(图2, 表3), 即高Cd积累品种‘YSL189’显著高于低Cd积累品种‘HZ903’, 在对照(Cd 0 μmol/L)处理中, 品种间这三个基因的表达量不存在显著差异, 这可能说明这三个基因对于Cd胁迫下的番茄Cd积累基因型差异有一定的贡献。

Nramp1、IRT1和IRT2的表达在0 μmol/L Cd处理时都是低Cd积累品种‘HZ903’的表达量显著高于高Cd积累品种‘YSL189’；Cd 50 μmol/L处理时Nramp1的表达量在品种间差异不显著, 而IRT1和IRT2都与对照处理表达规律相同, 即在低Cd积累品种‘HZ903’根中的表达量显著高于高Cd积累品种‘YSL189’； Cd 100 μmol/L处理时,IRT1表达无品种间差异,Nramp1在低Cd积累品种‘HZ903’根中表达量显著高于高Cd积累品种‘YSL189’, 而IRT2的表达刚好相反。由此推测,Nramp1、IRT1和IRT2可能对于低Cd环境下的Cd积累基因型差异起到一定的作用, 而在高Cd环境下, 则可能参与吸收的Cd在植株体内的再分配过程, 比如根茎部分的转运或液泡区室化等, 还有待于进一步研究。

2.3 TBARS—膜质过氧化产物差异分析

活性氧的产生是所有重金属对植物毒害作用的共性, 而巴比妥酸反应底物(TBARS)则是活性氧对膜脂过氧化作用的产物, 也是衡量膜脂受重金属毒害程度的一项指标。图3可以看出, 与对照处理(0 μmol/L Cd)相比, Cd处理显著增加了植株体内的TBARS含量, 根部增加的幅度最大, 茎部次之, 叶片增加幅度最小。这说明, Cd胁迫对植株各部位的细胞膜脂结构有不同程度的破坏作用, 且与植株各部位的Cd积累量差异趋势一致(表3), 根部Cd积累量最高, 细胞膜质受到损伤的程度也最严重, TBARS含量最高, 茎部次之, 叶片受到毒害效应最小。从品种间的差异来看, Cd处理浓度分别为50 和100 μmol/L 条件下, 虽然根部及茎部的Cd积累量都是‘YSL189’显著高于‘HZ903’, 但是‘TBARS’含量则不存在品种间差异, 即在Cd浓度存在显著差异的前提下, 品种间膜质过氧化程度没有显著差异, 这说明高Cd积累品种‘YSL189’细胞对Cd的耐受能力强于低Cd积累品种‘HZ903’。

2.4 抗氧化酶对镉胁迫响应差异

重金属含量超过临界值后都会干扰植物的正常代谢, 产生活性氧并带来氧化胁迫, 而植物对氧化胁迫的敏感性及其解毒活性氧的能力是决定植物对重金属耐性的重要因素[9-11,19]。在Cd 50和100 μmol/L胁迫下, 根、茎的SOD、POD和CAT活性都是‘YSL189’高于‘HZ903’, 且除Cd 50 μmol/L处理下的根部CAT和茎部SOD外, 差异都达到显著水平(P<0.05)(表4), 这与Cd浓度的品种间差异趋势一致(表3), 说明‘YSL189’植株内高浓度的Cd导致了高强度的氧化胁迫, 进而也导致了植株体内抗氧化酶的高活性。根、茎部的高POD, SOD和CAT活性显示了Cd胁迫下‘YSL189’对活性氧的清除能力高于‘HZ903’(表4), 因此, 我们推测‘YSL189’根、茎部的高POD, SOD和CAT活性可能是其TBARS含量与HZ903没有显著差异的原因之一。

叶部情况则不同, 在Cd 50和100 μmol/L胁迫下, 虽然Cd含量仍然是‘YSL189’显著高于‘HZ903’(表3), 而且POD和SOD的活性也是‘YSL189’显著高于‘HZ903’(表4), 但这似乎并不能弥补显著高的Cd浓度带来的活性氧对膜质的过氧化伤害, TBARS的含量仍然是‘YSL189’显著高于‘HZ903’(图3)。表4数据可以看出, 在Cd 50和100 μmol/L胁迫下, ‘YSL189’叶部CAT活性显著低于‘HZ903’, 说明不同抗氧化酶对Cd胁迫的响应也不同, 而且与品种特性及植株部位密切相关。

3 讨论与结论

不同植物种类对重金属胁迫有不同的耐受机制, 这种不同机制也存在于同一作物的不同品种间[20-21]。与‘HZ903’相比, 高Cd积累品种‘YSL189’根、茎部Cd含量高, 抗氧化酶SOD、POD和CAT活性高, 我们推测‘YSL189’根、茎部具有较强的活性氧清除能力, 而这也是品种间根、茎部TBARS含量在Cd 50和100 μmol/L处理下没有显著差异的原因之一。这与Noushina等[22]的研究结果不同, Noushina等报道高Cd积累的芥菜品种具有较高的TBARS含量及SOD的活性, 而CAT的活性则较低, 这可能与作物类型及植株部位有关。不管品种间抗氧化酶活性的差异如何, 我们的结果显示Cd处理都显著增加供试品种植株各部位的抗氧化酶活性, 而Maria等[11]以豌豆幼苗作为研究材料, 发现Cd 50 μmol/L就可以降低CAT、CuZn-SOD和Mn-SOD的活性。可见, 不同物种及不同品种间, 甚至不同植株部位间抗氧化酶对Cd的耐性都存在差异, 还有待于进一步深入研究。同时,在大多数植物中, Cd的浓度都是根>茎>叶[23-24], 这说明在大多数植物中, Cd主要在木质部运输, 而不易在韧皮部运输[23-24], 这与我们的研究结果一致。

注(Note): 表中数据为三次重复的平均值±SE Values are means±SE(n=3); 数值后不同小写字母表示同一抗氧化酶在不同处理、品种或植株部位间差异显著(P<0.05)Values followed by different lower-case letters indicate significantly differ among treatments, cultivars or tissues of the same antioxidant enzyme atP<0.05 according to Duncan’s multiple range test.

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Differential responses of two tomato cultivars to cadmium stress

ZHAO Shou-ping, ZHANG Yong-zhi, ZHANG Qi, WANG Gang-jun, YE Xue-zhu*

(ZhejiangProvinceKeyLabforFoodSafety/InstituteofQualityandStandardforAgro-products,ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences,Hangzhou310021,China)

【Objectives】To investigate the different responses of Cd accumulation in tomato cultivars exposed to Cadmium stress, a hydroponics experiment at seedling stage was performed using two tomato varieties, YSL189 with high Cd accumulation and HZ903 with low Cd accumulation, which were confirmed by our previous research. 【Methods】The experiment was performed in growth chamber, and morphological index, antioxidant enzyme activity, differences in Cd accumulation, ionic absorption rate and related gene expression in varieties were analyzed using seedling exposed to Cd 50 and 100 μmol/L. 【Results】 When exposed to 50 and 100 μmol/L of Cd, the root length of plants was more sensitive to Cd stress than plant height and biomass. Cultivar YSL189 exhibited higher tolerance in biomass and plant height, but lower root length than HZ903. Under both 50 and 100 μmol/L Cd treatments, the accumulation of Cd was reduced significantly in the order of roots, stem and leaves accordingly, and the Cd concentration in roots, stem and leaves of YSL189 was significantly higher than in those of HZ903. When the concentration of Cd in culture medium was over 20 μmol/L, the uptake rate of Cd in the roots of YSL189 was significantly higher than that in the roots of HZ903. The results of Real-Time PCR proved that the expression levels of transporter genesNramp2,Nramp3 andZIPin the roots of YSL 189 were higher than those in the roots of HZ903, and higher activities of SOD(superoxide dismutase), POD(peroxidase) and CAT(atalase) in roots and stems, SOD and POD in leaves were higher in YSL189 than those in HZ903, but no significant difference in concentration of TBARS(thiobarbituric acid reactive substance) between cultivars was found, indicating the degree of lipid peroxidation. 【Conclusion】 The higher Cd accumulation in YSL189 may be partly attributed to the higher Cd uptake rate, expression levels ofNramp2,Nramp3, andZIPin roots of YSL189 were higher than those of HZ903; and the higher activities of antioxidant enzymes in YSL189 were induced by higher Cd concentration, indicating the stronger power to detoxify reactive oxygen species for YSL189 than HZ903.

cadmium； tomato； transporter； antioxidase

2014-04-21 接受日期: 2014-11-25 网络出版日期: 2015-04-21

浙江省农业科学院重点实验室前瞻项目资助。

赵首萍(1976—)，女，黑龙江人，博士，助理研究员，主要从事植物营养研究。Tel: 0571-86419052, E-mail: zhaosppaper@163.com *通信作者Tel: 0571-86415206，E-mail: zhaosppaper@163.com

S511；S143.1

A

1008-505X(2015)05-1261-08