microRNA-141在结肠癌中的表达分析研究*

王亚南,陈昭华,陈卫昌

(1.苏州大学附属第一医院消化内科 215006,2.苏州市立医院本部/南京医科大学附属苏州医院本部检验科 215002)

microRNA-141在结肠癌中的表达分析研究*

王亚南1,2,陈昭华2,陈卫昌1△

(1.苏州大学附属第一医院消化内科 215006,2.苏州市立医院本部/南京医科大学附属苏州医院本部检验科 215002)

目的分析microRNA141(miR-141)在结肠癌组织中的表达及意义｡方法 采用荧光定量PCR(SYBR Green)法检测48例结肠癌组织和对应癌旁正常组织中miR-141的表达｡结果miR-141在结肠癌组织中的相对表达量为5.19±0.52,与对应癌旁正常组织1.01±0.13比较差异有统计学意义(P0.05);随着结肠癌分化程度的降低结肠癌组织中miR-141的表达增高;miR-141在淋巴结转移组的相对表达量为6.05±0.14,在淋巴结无转移组中为4.30±0.23,差异有统计学意义(P0.05)｡结论miR-141高表达可能与结肠癌的分化程度和淋巴结有无转移有关｡miR-141的出现为结肠癌的研究提供了新的切入点｡

结肠肿瘤;微小RNA-141;实时PCR

microRNA(miR)是一类新发现的非编码小RNA分子,通常在转录后水平调控基因表达｡结肠癌的形成是一个多基因､多阶段､长期复杂的过程｡至今,在人类基因组中已发现1 000多个miR[1],它们广泛参与器官发育､肿瘤发生､细胞增殖分化以及细胞凋亡等生理过程[2-3]｡miR-141是 miR-200家族中的一员,是一种具有上皮组织细胞特异性的微小RNA[4]｡本文采用实时定量(real-time)PCR技术检测 miR-141在结肠癌组织和相对应癌旁正常组织中的表达情况,分析其与各临床病理参数之间的关系,探索miR-141在结肠癌中的表达,为研究miR-141在结肠癌中的作用提供前期科学数据｡

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集苏州市立医院本部2011年6月至2012年10月48例住院的结肠癌患者,其中男22例,女26例,平均年龄61.2岁,均未经任何手术治疗以及放､化疗,均经病理确诊｡本研究经过院伦理委员会同意并签署患者知情同意书｡取组织标本离体后10min内置于液氮罐内迅速冷冻后置-80℃保存｡

1.2 主要试剂与仪器 Trizol总RNA提取试剂购自天根生化科技(北京)有限公司,miR-cute miRNA cDNA第一链合成试剂盒､miR-cute miRNA荧光定量检测试剂盒购自北京天根生化科技有限公司｡LifePro普通PCR仪(博日科技),PCR System7500扩增仪(美国ABI公司),Eppendof高速冷冻离心机(德国Eppendof公司),超低温冰箱､生物安全柜(上海瑞仰)｡

1.3 实时定量PCR(real time PCR)反应 正向引物由天根生化科技(北京)有限公司设计合成(引物序列暂不提供),miR-141上游引物目录号为CD201-0216,内参miR-16的上游引物目录号为CD201-0235｡反向引物为天根miR-cute miRNA荧光定量检测试剂盒配套提供｡组织总RNA提取,合成的cDNA于-20℃冰箱保存｡PCR反应体系为20μL:2×miR-cute miRNA Premix(含SYBR,含 ROX)10.0μL,正向引物(10μmol/L)0.4μL,反向引物(10μmol/L)0.4μL,miRNA第一链cDNA 2.0μL,50×ROX Reference Dye 1.6μL,ddH2O 5.6μL｡扩增程序:94℃预变性2min;94℃20s,60℃34s,43个循环｡

1.4 结果计算 所有反应设立3个复孔,记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数(Ct值),以miR-16作为内参照,对目标基因进行归一化处理,以确保相等数量的样品中比较目标基因的量｡采用定量PCR中的相对定量法,表达量倍数的变化用 F=2-△△Ct法计算｡△△Ct=(CtmiR-141-CtmiR-16)结肠癌组织-(CtmiR-141-CtmiR-16)癌旁组织｡

1.5 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行统计分析,采用单样本Kolmogorov-Smirnov检验法作数据正态分布检验,符合正态性分布计量资料采用±s表示,比较采用成组设计的两样本t检验,多组数据的比较采用单因素方差分析｡以P0.05为差异有统计学意义｡

2 结 果

2.1 结肠癌组织中miR-141和miR-16PCR产物电泳结果扩增片段经3%琼脂糖电泳,可见明亮､清晰､电泳条带,且与理论大小一致(miR-141扩增片段79bp,miR-16扩增片段79 bp),见图1｡

图1 结肠癌组织miR-141和miR-16PCR产物电泳图

* 基金项目:南京医科大学校基金项目(2011NJMU166)｡作者简介:王亚南(1980-),主管检验师,博士在读,主要从事结肠癌研究｡△通讯作者,Tel:13962101298;E-mail:weichangchen@126.com｡

2.2 miR-141在结肠癌组组织和相对应癌旁正常组织中的表达 以 miR-16为内参,用real-time PCR(SYBR Green)检测miR-141在结肠癌组和相对应癌旁正常组织中的表达｡结果显示miR-141在结肠癌组织中的相对表达量为5.19±0.52,与癌旁正常组织中 miR-141的表达量(1.01±0.13)比较,差异有统计学意义(P0.05)｡见图2｡

图2 miR-141在结肠癌组织和癌旁正常组织中的表达

2.3 结肠癌组织miR-141表达与临床病理特征的关系 结肠癌组织miR-141在不同的年龄组中的表达差异无统计学意义(P0.05);结肠癌组织miR-141在男性和女性中的表达差异无统计学意义(P0.05);结肠癌组织miR-141在结肠癌肿块直径小于或等于5cm和肿块直径大于5cm组中的表达差异无统计学意义(P0.05);结肠癌组织 miR-141在高分化､中分化､低分化肺癌组织中的相对表达量分别为3.36±0.18､4.98±0.22､5.32±0.25,差异有统计学意义(P0.05),随着分化程度的降低结肠癌组织miR-141的表达增高;结肠癌组织miR-141在淋巴结有转移组的相对表达量为6.05±0.14,在淋巴结无转移组中为4.30±0.23,经统计学分析差异有统计学意义(P0.05),见表1｡

表1 结肠癌组织miR-141表达与临床病理特征的关系(±s)

表1 结肠癌组织miR-141表达与临床病理特征的关系(±s)

项目 n miR-141的表达P年龄(岁)0.4240 10 5.16±0.15 40～60 20 5.24±0.16>60 18 5.18±0.22性别0.31男22 5.16±0.19女26 5.22±0.22肿块直径(cm)0.39≤5 32 5.22±0.24>5 16 5.45±0.19分化程度0.01高分化 13 3.36±0.18中分化 20 4.98±0.22低分化 15 5.32±0.25淋巴结转移0.02有28 6.05±0.14无20 4.39±0.23

3 讨 论

结肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤,是结肠黏膜上皮在环境或遗传等多种致癌因素作用下发生的恶性病变,其发生发展是多基因､多步骤作用的结果｡miR是一类非编码小RNA分子,成熟的miR一般有19～25个碱基,通常在转录后水平调控基因表达[5]｡成熟的 miR能够识别特定的 mRNA,通过与靶基因mRNA 3′-UTR完全或不完全配对来促进目标mRNA的降解或抑制目标mRNA的翻译过程而发挥负调控基因表达的作用[6]｡miR的异常表达或基因突变将对细胞的正常周期和生理过程产生影响从而引起肿瘤的发生[7-8]｡目前,已有研究证实,miR通过参于基因调控影响蛋白表达水平而影响结肠癌的进展,而且不同的miR在结肠癌的作用不同,甚至相同的miR在不同类型的结肠癌中的表达也不相同｡

miR-141属于miR进化保守家族的一员,是一种具有上皮组织细胞特异性的miR｡miR-141作为miR-200家族的成员之一,在乳腺癌､前列腺癌中表达增高,而在肝细胞肝癌和胰腺癌中表达降低[9],目前国内关于miR-141在结肠癌中表达的研究不多｡本文结果提示miR-141在结肠癌组织中显著高表达｡并且作者发现随着结肠癌分化程度的降低结肠癌组织中miR-141的表达增高,其表达量的上调在诊断结肠癌的分化程度方面有较高的敏感性,这提示miR-141可作为结肠癌肿瘤分化程度的一个良好的辅助指标｡本文研究还发现在miR-141的高表达与淋巴结转移有关(P0.05),推测它可能作为癌基因参与结肠癌的进展过程,它通过负性抑制抑癌基因和/或通过控制细胞的分化或凋亡途径来促进结肠癌的发展｡提示miR-141可能作为癌基因在结肠癌的进展阶段起作用,可以反映结肠癌进展程度,具有临床病理学诊断价值,也可以作为判断结肠癌肿瘤预后的一个辅助诊断标准｡但本文研究发现miR-141的表达和结肠癌肿块大小无关,提示在肿块生长过程中miR-141可能不参与或不发挥作用｡

本文结果显示结肠癌组织中miR-141的高表达,这为后期研究miR-141在结肠癌肿瘤发生发展中的作用提供了科学依据｡截止目前,结肠癌的发病机制仍不明确,miR-141的出现为结肠癌的研究提供了新的切入点｡

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R735.35

B

1671-8348(2015)16-2250-03

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.16.032

2014-10-08

2015-01-16)

•调查报告•