从自然发酵小麦酱中筛选曲霉及制曲工艺研究

陈清婵，简清梅*，王劲松，孙爱红，李蓉

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

从自然发酵小麦酱中筛选曲霉及制曲工艺研究

陈清婵，简清梅*，王劲松，孙爱红，李蓉

（荆楚理工学院生物工程学院，湖北荆门448000）

从自然发酵的小麦酱中分离得到4株黄曲霉（Aspergillus flavus）和2株黑曲霉（Aspergillus niger），对其进行生理效价分析，结果表明，黄曲霉4号产糖化型淀粉酶和蛋白酶能力最强，且具有较强的产α-淀粉酶和酯化酶的能力，适合作为小麦酱制曲的发酵菌株。对其制曲工艺进行优化，结果表明，在接种量为4%，制曲温度为32℃，制曲时间为70 h的条件下，小麦曲的蛋白酶酶活力为549 U/g，较自然发酵制曲的481 U/g有较大提高。

小麦酱；曲霉菌种；制曲

小麦酱作为我国广大农村一种传统的调味品，是以小麦为主要原料生产的酱类，一直以来由传统家庭式自然发酵方法生产，成品香气浓郁，风味俱佳，可代替酱油使用，且具有一定的保健功能，深受人们喜爱[1]。现今，市面上销售酱制品主要以面酱[2-3]、黄豆酱[4]、豆瓣酱[5]、豆豉[6]为主，且对这些酱品的菌相分析和加工工艺都已进行过广泛研究。而小麦酱在市面少见，且相关研究较少。对小麦酱实行规模化生产，具备良好的经济效益与社会效益。

发酵剂的优劣对发酵产品色泽、风味、口感等品质的影响尤其重要，故优良的酱类发酵剂应该来自于自然发酵生产的优质酱产品[7]。对于小麦酱而言亦是如此，较优良的发酵剂菌种对于研究小麦酱发酵剂非常重要。传统发酵小麦酱色泽鲜亮，口感极佳，这同参与其中的各种微生物发酵作用是紧密相关的。

酱制品的酿造过程可分为两个主要的阶段：制曲阶段和高盐发酵阶段。在制曲阶段起作用的主要是霉菌，其功能是产酶（淀粉酶、蛋白酶、酯化酶等）。由于各个地方气候条件的差异，空气中的微生物组成也各不相同，因此各地发酵产生的酱制品风味各异。酱类制品的工业化生产制曲所用菌种多为米曲霉，也有用黑曲霉和混合菌种制曲的。米曲霉中用得最多的是沪酿3.042[8]，也有些使用自己从自然界分离的菌种，如米曲霉Y29[9]、QU3601[10]等。本实验以湖北荆门地区仙居小麦酱为研究对象，从小麦酱的传统发酵曲中分离与小麦酱色、香、味有关的霉菌种类，筛选优良菌种，以及研究小麦酱人工接种制曲发酵的最佳工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

传统自然条件下制作的小麦曲：取自湖北荆门仙居小麦酱；小麦、土豆：市售；蔗糖（分析纯）、琼脂（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，自来水1 000 mL；自然pH；种曲培养基：麸皮8 g，面粉2 g，水10 g，于121℃灭菌20 min。

1.2 仪器与设备

LRH-150-S电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；BYY-200B恒温摇床：常州博远实验分析仪器厂；YQL-100SII立式压力蒸汽灭菌锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；TU-1901紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；JJ-CJ-2FD型双人单面净化工作台：苏州金净科技有限公司；90-2型恒温磁力搅拌器：上海亚荣生化仪器厂；E-201-C型PH复合电极：上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 霉菌的酶活力检测方法

将分离得到的霉菌接种至马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板培养基中，挑取单菌落重新接种至新鲜培养基斜面，重复3次达到活化。根据霉菌孢子浓度作适当的稀释，最后保持相同的孢子浓度接种到种曲培养基中，于30℃培养40 h后取样检测结果。

取5 g样品，置于250 mL三角瓶中，加入50 mL生理盐水，30℃、150 r/min恒温摇床振摇30 min，用4层纱布过滤获得酶液，供测定用。

α-淀粉酶（液化型淀粉酶）的检测：GB 8275—2009《食品添加剂α-淀粉酶制剂》[11]；糖化型淀粉酶的检测：GB 8276—2006《食品添加剂糖化酶制剂》[12]；蛋白酶的检测：GB/T 23527—2009《蛋白酶制剂》[13]。

酯化酶活力的测定[14]：取10 mL环己烷、3.65 mL乙醇、6.25 mL己酸（所有试剂每500 mL加入30 g无水硫酸钠）及0.2 mL酶液，酯化反应在密闭的100 mL锥形瓶中进行，反应温度为36℃，24 h后，取上清液0.5 mL于50 mL锥形瓶中，加入5 mL水，2滴酚酞，滴定至终点，测定己酸消耗量。

酶活力单位定义：在测定条件下每分钟消耗1 μmol己酸所需要的酶量为1个酶活力单位，U。

1.3.2 黄曲霉素的测定

GB/T5009.22—2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》[15]。1.3.3小麦酱制曲工艺参数确定

（1）接种量：将蒸熟的小麦分别接种3%、4%、5%、6%、7%曲霉，在30℃温度条件下发酵48 h进行试验，根据测定曲霉蛋白酶活力确定最佳接种量。

（2）制曲温度：将蒸熟的小麦接种3%曲霉，分别设定制醅温度为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，发酵48 h进行试验，以曲霉蛋白酶活力为主要指标，确定最佳制曲温度。

（3）制曲时间：将蒸熟的小麦接种3%曲霉，在30℃温度条件下，分别发酵46 h、54 h、62 h、70 h、78 h进行试验，以曲霉蛋白酶活力为主要指标，确定最佳制曲时间。

2 结果与分析

2.1 优势霉菌菌株的鉴定[16-17]

从小麦酱曲中挑取其中的优势菌株纯化后转至斜面保存以备鉴定之用。经过对霉菌的分离纯化，最后在传统样中分离得到6株菌，根据菌落形态和显微镜下分生孢子头形态观察，得到1～4号菌菌落初带黄色，然后变成黄绿色，老后颜色变暗，反面无色。低倍显微镜下观察可见分生孢子头呈疏松放射状，有时形成不明显的柱状，分生孢子头呈黄-绿色至深橄榄-褐，分生孢子梗粗糙无色，初步判断属于黄曲霉群。以下分别标号黄1、黄2、黄3、黄4；5～6号菌菌丝初为白色，厚绒状；菌落表面黑色，反面无色。分生孢子头幼时球形，后变成放射形，初步判断为曲霉科，属于黑曲霉群。以下分别标号黑1、黑2。

2.2 霉菌酶活力检测结果

2.2.1 霉菌产淀粉酶能力的比较

6种不同霉菌产液化型淀粉酶（α-淀粉酶）和糖化型淀粉酶能力如图1所示。

由图1可见，黑1号曲霉产α-淀粉酶能力最高，黑2号和黄4号曲霉产α-淀粉酶能力也较强。黄4号曲霉产糖化型淀粉酶能力最强，其他菌种均较弱。

2.2.2 霉菌产蛋白酶能力的比较

不同霉菌产中性蛋白酶能力结果如图2所示。

由图2可见，黄1、黄4和黑1号菌株产中性蛋白酶能力都较强，其中黄4号产蛋白酶的能力最强。

2.2.3 霉菌产酯化酶能力的比较

不同霉菌产酯化酶能力结果如图3所示。

由图3可见，黑1号曲霉产酯化酶的能力最强，其次是黄1和黄4号菌株。

综合以上数据，黄4号曲霉其各项产酶能力都较高，可以作为人工单菌种发酵制小麦曲菌种。对其进行黄曲霉素检测，结果表明其不产黄曲霉毒素，可以用于生产制曲。

2.3 制曲工艺的确定

将筛选出的黄4号曲霉作为小麦酱发酵菌种，通过研究其在不同接种量、时间和发酵温度条件下所产生的蛋白酶活力变化，确定其制曲工艺参数。

2.3.1 接种量的影响

接种量对小麦曲蛋白酶酶活的影响结果如图4所示。

由图4可知，接种量为4%时，麦曲里蛋白酶酶活达到最大，之后随着接种量的增加蛋白酶酶活反而减少，接种量在5%和6%时，蛋白酶活力变化平缓，可在7%的接种量时蛋白酶活力迅速减小。这可能是曲霉接种量过多不宜于菌种之间的生长，接种量太大，营养物质有限，不足以维持曲霉的生长所需，将形成大量的休眠孢子，降低酶的活性。曲霉接种量太少的话，繁殖量达不到要求，会造成营养浪费。因此，确定小麦酱制曲的最佳接种量为4%。

2.3.2 制曲温度的影响

制曲温度对小麦曲蛋白酶酶活的影响结果如图5所示。

由图5可知，适宜的温度有利于微生物的繁殖，产生较高的蛋白酶酶活。随着制曲温度上升，小麦曲的蛋白酶活逐渐升高，在32℃时达到峰值，这与曲霉最适生长温度在30℃左右的结果是相符合的。温度过高过低都不利于微生物的生长。因此确定纯种发酵麦酱制曲最佳温度为32℃。

2.3.3 制曲时间的影响

制曲时间对小麦曲蛋白酶酶活的影响结果如图6所示。

由图6可知，接种后的小麦曲随着制曲时间的增长，其蛋白酶活力也逐渐增高，70 h时酶活最高。制曲时间过长，微生物进入衰弱期，蛋白酶分泌量降低，同时蛋白质降解过度，反而影响了小麦酱风味。观察曲霉孢子密度、颜色深浅、曲料香味，也可以确定最佳制曲时间为70 h。

3 结论

从自然发酵小麦酱曲中分离纯化得到6种霉菌，对其进行α-淀粉酶、糖化型淀粉酶、蛋白酶和酯化酶产酶能力的测定，经综合考虑，筛选出黄曲霉4号菌株为最适于单菌种发酵制小麦酱的菌株。研究接种黄4号曲霉制备小麦酱曲工艺，确定最佳制曲工艺参数为接种量4%，制曲时间70 h，制曲温度32℃。在此条件下制得的小麦曲蛋白酶活力达到549 U/g，而自然发酵制曲的蛋白酶活力481 U/g。由此可见，筛选出的黄4号曲霉菌株经过优化工艺制曲，不仅缩短了制曲时间，同时提高了小麦曲的质量，为小麦酱的进一步发酵提供有益条件。

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CHEN Qingchan,JIAN Qingmei*,WANG Jinsong,SUN Aihong,LI Rong
(College of Bioengineering,Jingchu University of Technology,Jingmen 448000,China)

FourAspergillus flavusstrains and twoAspergillus nigerstrains were isolated from natural fermented wheat paste,and the physiological value of the strains were analyzed.Results showed thatA.flavus4 had the strongest ability to produce saccharifying amylase and protease,and strong ability to produce α-amylase and ester enzyme,which was suitable for fermenting wheat paste.The optimum fermentation conditions were strain inoculum 4%,starter-making temperature 32℃and time 70 h.Under this condition,the wheat starter protease activity was 549 U/g,which was much higher than that in the natural fermented koji(481 U/g).

wheat paste;Aspergillusstrains;koji making

TS264.2

A

0254-5071（2015）04-0086-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.04.019

2015-04-01

荆门市级研究与开发引导计划项目（2013YD43）

陈清婵（1983-），女，讲师，博士，研究方向为风味食品。

*通讯作者：简清梅（1975-），女，副教授，硕士，研究食品营养与安全。