山楂多糖的提取及其抗氧化性作用

郑朋朋，李 珊，戚丽蓉，杨正涛，张 婷，敖新宇

（西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224）

山楂多糖的提取及其抗氧化性作用

郑朋朋，李 珊，戚丽蓉，杨正涛，张 婷，敖新宇*

（西南林业大学生命科学学院，云南昆明650224）

为确定大别山产山楂多糖的最佳提取工艺条件和多糖的抗氧化活性，在单因素试验的基础上，通过Plackett Burman试验进行统计学筛选后，响应面法进行优化；通过对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、羟自由基和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基清除试验测定山楂多糖抗氧化活性。结果表明，山楂多糖最佳提取条件为液料比28∶1（mL∶g）、浸提温度79℃，醇析乙醇体积分数71%。在此条件下，山楂多糖的提取率为7.97%。结果表明，山楂多糖具有清除DPPH自由基、羟基自由基和ABTS自由基的能力。

山楂；多糖；响应面法；抗氧化性

多糖在生物体内承担重要的生理功能，如细胞信号传导、受体识别、免疫反应等。另外多糖具有抗肿瘤、增强免疫力、抗疲劳等多种生物活性，成为近年研究的热点之一[1-2]。

山楂（Crataegus pinnatifida）为蔷薇科山楂属植物，在中国已有悠久的食用和药用历史，是一种重要的植物资源[3-4]。山楂中主要含黄酮类、多酚类、多糖、三萜类、有机酸类、甾醇类、胡萝卜素、氨基酸等化学成分及微量元素等[5-8]。据文献报道，山楂多糖具有降血压、降血脂、增强免疫、抑菌等功能[9-11]。本研究通过PB试验对山楂多糖提取过程中的超声处理时间、液料比、浸提温度、提取时间、醇析乙醇体积分数5个因素进行统计学筛选，响应面优化试验进一步优化多糖提取条件，同时对山楂多糖体外抗氧化性作用进行研究，从而为山楂的综合开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山楂：采摘自安徽省安庆市岳西县的野生山楂，新鲜山楂去核后放入60℃烘箱中烘至质量恒定，粉碎机粉碎，过80目筛，放入广口瓶，储存于干燥瓶中备用。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azinobis（3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnic acid）diammonium salt，ABTS）：美国Sigma公司；30%双氧水、甲醇、乙醇、氯仿、正丁醇、浓硫酸、苯酚、葡萄糖：汕滇药业有限公司；水杨酸、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、过硫酸钾：国药集团化学试剂有限公司。所有化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

DHG-9240A型电热恒温鼓风干燥箱、HWS-12水浴锅：上海一恒科学仪器有限公司；BS224S电子天平：德国Sartorius公司；M20粉碎机：KIKA-WERKE公司；B490真空旋转蒸发仪：瑞士Buchi公司；FD5-8冷冻干燥机：美国GoldSim公司；AS20500B超声波清洗仪：台湾信达电子仪器有限公司；TU-1901紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；5430R离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 多糖提取与测定

葡萄糖标准曲线绘制：准确称取100.0mg葡萄糖（105℃烘干至质量恒定），溶解后定容至1 L，配制成100 μg/mL的葡萄糖储备液；分别取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL葡萄糖储备液于试管中，补水至1.0 mL，得质量浓度为0、20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL葡萄糖溶液，分别加入4%苯酚1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，待冷却后，在波长490 nm处测定吸光度值。

多糖提取：采用热水浸提乙醇沉淀法提取山楂多糖。准确称取2.0 g山楂粉，置于100 mL的具塞三角瓶中，在选定的超声时间（超声功率520 W）、液料比、浸提温度、提取时间和醇析乙醇体积分数条件下水浴浸提；提取完成后5 000 r/min离心12min，将上清液旋转蒸发浓缩为5 mL后，加一定量无水乙醇静置沉淀12 h；6 000 r/min离心20 min、多糖沉淀复溶于水中，用Sevag法除蛋白后，冷冻干燥后，再配成水溶液，并定容到100 mL待测。

取1.0mL稀释10倍后的多糖待测液，加入4%苯酚1.0mL、浓硫酸5.0 mL，放入水槽中冷却10 min，待冷却后，在波长490nm处测定吸光度值。多糖提取率计算公式如下：

式中：A为样品待测液的吸光度值；m为样品的质量，g。

1.3.2 单因素试验

超声处理时间：超声处理时间分别在0、10min、20min、30 min、40 min、50 min，液料比40∶1（mL∶g）、浸提温度60℃、提取时间120 min、醇析乙醇体积分数80%的条件下，考察不同超声处理时间对多糖提取率的影响。

液料比：液料比分别在10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g），超声处理时间30 min、浸提温度60℃、提取时间120 min、醇析乙醇体积分数80%的条件下，考察不同液料比对多糖提取率的影响。

浸提温度：浸提温度分别在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，超声处理时间30 min、液料比30∶1（mL∶g）、提取时间120 min、醇析乙醇体积分数80%的条件下，考察不同浸提温度对多糖提取率的影响。

提取时间：提取时间分别在60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min，超声处理时间30 min、液料比30∶1（mL∶g）、浸提温度80℃、醇析乙醇体积分数80%的条件下，考察不同提取时间对多糖提取率的影响。

醇析乙醇体积分数：乙醇体积分数分别在40%、50%、60%、70%、80%、90%醇析，超声处理时间30 min、液料比30∶1（mL∶g）、浸提温度80℃、提取时间150 min的条件下，考察不同提取时间对多糖提取率的影响。

1.3.3 Plackett Burman试验

根据单因素试验，对超声处理时间、液料比、浸提温度、提取时间、醇析乙醇体积分数5个因素进行Plackett Burman试验设计[12-13]。以多糖提取率（Y）为响应值；通过Design-Expert 8.0.6软件对试验结果进行主效应分析。试验设计因素与水平见表1。

1.3.4 响应面优化试验

根据单因素和Plackett Burman试验，选取液料比（A）、浸提温度（B）和醇析乙醇体积分数（C）3个因素，采用Box-Behnken中心组合设计原理设计3因素3水平的响应面优化试验[14-15]，以-1、0、1代表因素的低中高3个水平，多糖提取率为响应值。响应面因素与水平设计见表2。

1.3.5 醇沉分级纯化山楂多糖

按照最佳优化条件提取山楂多糖，干燥得到粗多糖，波长190～400 nm范围内进行紫外扫描，260～280 nm波段未出峰则说明粗多糖中蛋白质除尽。

称取5 g干燥的粗多糖复溶入50 mL蒸馏水中，加乙醇使其体积分数为40%，沉淀12 h，6 000 r/min离心20 min，得到40%醇沉级分HPS1，上清液中继续添加乙醇，使其体积分数为60%，离心得到60%醇沉级分HPS2，上清液再加乙醇，使其体积分数为80%，离心得到80%醇沉级分HPS3。

1.3.6 抗氧化性试验[16-19]

多糖清除DPPH自由基能力测定：将山楂多糖HPS1和HPS2用蒸馏水配制成质量浓度10mg/mL的样品储备液，分别稀释成不同质量浓度梯度（1mg/mL、2mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL）后，取1.0 mL不同质量浓度的样品溶液（不同质量浓度的VC溶液作为参比）于试管中，分别加入2.0 mL提前配制的DPPH溶液（0.004 0 g DPPH，甲醇定容至100 mL，4℃冰箱避光放置），振摇混匀后置于暗室中静置40 min，于波长517 nm处测定吸光度值，1.0 mL不同质量浓度的样品溶液与2.0 mL甲醇混合液测定样品本底吸光度值，2.0 mL DPPH与1.0mL甲醇混合液测定对照溶液吸光度值，DPPH自由基清除率计算公式如下：

式中：Ax为不同样品溶液吸光度值；Ax0为样品本底吸光度值；A0为对照溶液吸光度值。

多糖清除羟自由基能力测定：在试管中逐次加入9 mmol/L FeSO4溶液1.0 mL、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1.0 mL、1.0 mL不同质量浓度样品溶液，最后加入8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL启动反应。将试管迅速移入37℃水浴锅中，静置反应30 min后于波长510 nm处测定不同质量浓度样品液的吸光度值。用蒸馏水代替H2O2测得对应质量浓度样品溶液的本底吸光度值，用蒸馏水代替样品溶液测得对照吸光度值。·OH清除率计算公式如下：

式中：Ax为不同样品溶液吸光度值；Ax0为样品本底吸光度值；A0为对照溶液吸光度值。

多糖清除ABTS自由基测定：用蒸馏水溶解ABTS，使ABTS浓度为7 mmol/L，加入过硫酸钾使过硫酸钾的浓度为2.45mmol/L，然后将该溶液在室温条件下避光反应16 h。再将生成的ABTS+·溶液，用磷酸缓冲液（PBS，pH=7.4）适当稀释，使其在30℃、波长734 nm处的吸光度值在范围内，得到ABTS自由基储备液。在试管中加入1.0 mL不同质量浓度样品溶液，再加入2.0 mL的ABTS溶液，混合摇匀，在室温条件下反应10 min后，在波长734 nm处测定其吸光度值。2.0 mL的蒸馏水代替ABTS溶液测定不同浓度样品溶液的本底吸光值，用蒸馏水代替样品溶液作为空白对照，ABTS自由基清除率计算公式如下：

式中：Ax为不同样品溶液吸光度值；Ax0为样品本底吸光度值；A0为对照溶液吸光度值。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

以葡萄糖溶液质量浓度（C）为横坐标，吸光度值（A）为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，结果见图1。

由图1可知，葡萄糖标准曲线线性回归方程：A=0.00906C-0.004 81；相关系数R2=0.998，表明二者线性关系良好。

2.2 单因素试验

2.2.1 超声时间对多糖提取率的影响

由图2可知，超声处理时间增加，山楂多糖的提取率开始不断增加，超声处理时间为30 min时的山楂多糖提取率最大，继续增加超声时间多糖提取率开始下降。超声波具有较强的机械剪切作用，长时间和大功率的作用会使大分子多糖链断裂，从而导致多糖提取率下降，表明最佳超声处理时间为30 min。

2.2.2 液料比对多糖提取率的影响

由图3可知，山楂多糖的提取率随着液料比的增加而增大，当液料比为30∶1（mL∶g）时，山楂多糖提取率达到最大值，液料比继续增加，多糖提取率略有降低，说明最佳液料比为30∶1（mL∶g）。

2.2.3 浸提温度对多糖提取率的影响

由图4可知，温度升高，山楂多糖的提取率随之增加，温度为80℃时，山楂多糖的提取率达到最大，温度继续升高，多糖提取率不增加，说明最佳浸提温度为80℃。

2.2.4 提取时间对多糖提取率的影响

由图5可知，提取时间延长，提取率随之增大，提取时间为150 min时，山楂多糖的提取率达到最大，继续延长时间，多糖提取率不增加，说明最佳提取时间为150 min。

2.2.5 醇析乙醇体积分数对多糖提取率的影响

由图6可知，随着乙醇体积分数增大，山楂多糖提取率先增加后降低，醇析乙醇体积分数为70%时，山楂多糖的提取率达到最大，说明最佳醇析乙醇体积分数为70%。

2.3 Plackett Burman试验

2.3.1 PB试验设计与结果

PB试验设计与结果见表3。

2.3.2 主效应分析

通过Design-Expert8.0.6对PB试验结果进行主效应分析，分析结果见表4所示。PB试验所建立的模型显著，R2= 0.985 5说明分析结果可靠。由表4中的P值和贡献值可见，液料比、浸提温度、醇析乙醇体积分数对多糖提取率贡献最大，其对多糖提取率的贡献大小为液料比＞浸提温度＞醇析乙醇体积分数，而超声处理时间、提取时间对多糖提取率的贡献相对较小，由E值可知液料比、浸提温度、醇析乙醇体积分数均表现出正效应，因此选取液料比、浸提温度、醇析乙醇体积分数设计响应面优化试验逼近最佳提取条件，而超声处理时间、提取时间则不进行响应面优化试验，在此后的试验中超声处理时间为30 min，提取时间为150 min。

2.4 响应面优化试验

2.4.1 响应面优化试验设计与结果

采用Desigin-Expert8.0.6软件中Box-Behnken中心组合设计响应面优化试验，设计3因素3水平共15个试验点，其中12个为析因点，3个为零点，试验设计与结果见表5。

2.4.2 回归模型建立与方差分析

由Design-Expert8.0.6软件对表5中的试验结果进行多元回归拟合，建立二次多项式回归模型，并对模型进行方差分析，结果如表6所示；对各因素进行二次多项式回归拟合后，得到二次项式回归方程：

多糖提取率=8.03-0.24A-0.089B-0.036C+0.28AB-0.17AC+（7.00E-0.3）BC-0.48A2-0.47B2-0.088C2

由表6方差分析可知，该回归模型的影响达到极显著水平（P＜0.01）。模型中的A、A2、B2对响应值影响极显著（P＜0.01）；B、AB、AC对响应值影响显著（P＜0.05），其他项系数均不显著（P＞0.05），这表明试验因素对响应值不是简单的线性关系。此模型的决定系数，说明响应值的变化有98.44%来源于所选变量，该方程与实际情况拟合良好，实验误差小，能够正确反映多糖提取率与料液比、浸提温度和醇析乙醇体积分数之间的关系。失拟项，差异不显著，表明建立的二次多项式回归模型可运用于山楂多糖提取条件的理论预测。

2.4.3 响应面分析结果

图7直观反映了各因素对响应值的影响，由图7可知，液料比（A）与浸提温度（B）及液料比（A）与醇析乙醇体积分数（C）之间的交互作用最为显著，其中，液料比对山楂多糖提取的影响最为显著，表现为曲线较陡；浸提温度次之；醇析乙醇体积分数的影响相对最小，表现为曲线较为平滑，且随其数值的增加或减少，响应值变化较小。

2.4.4 验证试验

选择合适的料液比、浸提温度、醇析乙醇体积分数可获得较高的山楂多糖的提取率，通过Design-Expert8.0.6软件分析，预测最佳提取条件为液料比28.41∶1（mL∶g）、浸提温度79.06℃、醇析乙醇体积分数70.89%，此条件下理论多糖提取率达8.08%。考虑到实际操作的方便，将各因素修正为液料比28∶1（mL∶g）、浸提温度79℃、醇析乙醇体积分数71%，在修正条件下进行验证试验，山楂多糖的提取率为7.97%，与理论预测值相比相对误差为1.3%。因此，采用响应面法优化得到的提取条件准确可靠，具有实用价值。

2.5 多糖的纯化

对提取除蛋白的山楂多糖进行紫外扫描，结果表明山楂多糖中不含有蛋白质。采用乙醇分级沉淀对山楂多糖进行纯化，得到HPS1、HPS2、HPS3三个级分山楂纯化多糖，其中获得较多HPS1、HPS2两个级分的纯多糖，而HPS3级分较少，因此未对HPS3级分纯化多糖进行抗氧化性研究。HPS1、HPS2的多糖含量分别为51.7%和58.3%。

2.6 抗氧化性试验

2.6.1 山楂多糖对DPPH自由基的清除能力

从图8可以看出，在试验质量浓度范围内，随着山楂多糖质量质量浓度的增加，HPS1、HPS2对DPPH自由基清除率呈逐渐上升趋势，两者对DPPH自由基清的除率基本一致，但是清除率均低于相同质量浓度条件下VC对DPPH自由基的清除率；HPS1、HPS2在5.0 mg/mL时的清除率最大，分别为51.3%和48.5%。VC在质量浓度0.2～1.0 mg/mL时，随着质量浓度的增加，其对DPPH自由基清除率增加迅速，超过1.0mg/mL后，清除率变化不大，维持在90%左右。整体来看，VC对DPPH自由基清除能力要强于山楂多糖。

2.6.2 山楂多糖对羟自由基（·OH）的清除能力

从图9可以看出，在试验质量浓度范围内，随着山楂多糖质量浓度的增加，HPS1、HPS2对·OH清除率呈逐渐上升趋势，在1.5～3.0 mg/mL之间HPS2要略大于HPS1的清除率，而在3 mg/mL之后HPS1要略大于HPS2的清除率，但是清除率均低于相同质量浓度条件下VC对·OH的清除率；HPS1、HPS2在5.0 mg/mL时的清除率最大，分别为53.7%和52.1%。VC在质量浓度0.2～1.0 mg/mL时，随着质量浓度的增加，其对·OH清除率增加迅速，超过1.0 mg/mL后，清除率基本没有变化，维持在83.6%。整体来看，VC对·OH清除能力要强于山楂多糖。

2.6.3 山楂多糖对ABTS自由基的清除能力

从图10可以看出，在试验质量浓度范围内，随着山楂多糖质量浓度的增加，HPS1、HPS2对ABTS自由基清除率呈逐渐上升趋势，在3 mg/mL之前两者对ABTS自由基清除率基本相同，而在3mg/mL之后HPS1逐渐大于HPS2的清除率，但是清除率均低于相同质量浓度条件下VC对ABTS自由基的清除率；HPS1、HPS2在5.0 mg/mL时的清除率最大，分别为59.3%和48.8%。VC在质量浓度0.2～2.0mg/mL时，随着质量浓度的增加，其对ABTS自由基清除率增加迅速，超过2.0mg/mL后，清除率基本没有变化，维持在93%左右。整体来看，VC对ABTS自由基清除能力要强于山楂多糖。

3 结论

在单因素试验的基础上，运用Plackett Burman试验和响应面优化试验对山楂多糖提取工艺进行优化，获得山楂多糖最佳提取条件为液料比28∶1（mL∶g）、浸提温度79℃，醇析乙醇体积分数71%。在此最佳条件下，山楂多糖的提取率为7.97%。结果表明，建立的回归模型拟合程度良好，理论值和预测值基本一致；体外抗氧化性研究表明，山楂多糖具有一定清除DPPH自由基、羟自由基和ABTS自由基的能力。

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Extraction and antioxidant activity of hawthorn polysaccharides

ZHENG Pengpeng,LI Shan,QI Lirong,YANG Zhengtao,ZHANG Ting,AO Xinyu*
(College of Life Science,Southwest Forestry University,Kunming 650224,China)

In order to determine the optimum conditions for polysaccharides extraction from hawthorn and its antioxidant activity,on the basis of single factor experiments,the results were screened by Plackett Burman(PB)test and optimized by response surface methodology.The optimum conditions for polysaccharides extraction from hawthorn were liquid-material ratio 28:1(ml:g),temperature 79℃,ethanol concentration 71%.Under the optimum conditions,the extraction ratio of polysaccharides was 7.97%.The hawthorn polysaccharides had the capability of scavenging DPPH radical,hydroxyl free radical and ABTS radical.

hawthorn;polysaccharides;response surface methodology;antioxidant activity

R285

A

0254-5071（2015）06-0107-07

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.06.024

2015-05-06

云南省优势特色重点学科生物学一级学科建设项目（50097505）

郑朋朋（1990-），男，硕士研究生，研究方向为生物化学与分子生物学。

*通讯作者：敖新宇（1978-），男，副教授，硕士，研究方向为分子生物学。