日本血吸虫混合与单性感染雌虫的形态观察及凋亡检测

韩 愉，乔洪宾，曹宇凡，陆 珂，李 浩，刘金明，林矫矫，金亚美

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

·研究论文·

日本血吸虫混合与单性感染雌虫的形态观察及凋亡检测

韩 愉，乔洪宾，曹宇凡，陆 珂，李 浩，刘金明，林矫矫，金亚美

（中国农业科学院上海兽医研究所 农业部动物寄生虫学重点开放实验室，上海 200241）

日本血吸虫混合与单性感染雌虫在形态上存在明显的差异，为了更进一步观察二者生殖器官的差异，本研究采用激光共聚焦观察感染雌虫卵巢和卵黄腺，透射电镜观察卵黄腺，并用原位末端转移酶标记法观察卵黄腺的凋亡水平。激光共聚焦结果表明，混合感染雌虫卵巢和卵黄腺可见成熟的细胞而单性感染雌虫仅存在未成熟的细胞；透射电镜结果表明两者卵黄腺细胞的细胞核和核仁在大小及形态方面有很大差异，混合感染雌虫可见明显的卵黄滴，单性感染雌虫无卵黄滴但有聚集和散在分布的脂滴；原位末端转移酶标记法结果表明，两者皆未呈现明显的凋亡现象。可见，混合与单性感染雌虫不仅在虫体大小和器官形态上，细胞形态和亚细胞结构也存在差异。

混合感染；单性感染；形态；凋亡；日本血吸虫

日本血吸虫（Schistosoma japonicum）成虫寄生在宿主肝门静脉和肠系膜静脉，性成熟雌虫在寄生部位持续产卵，虫卵一部分随血流进入并滞留于宿主肝脏最终引起宿主肝脏的虫卵肉芽肿，造成宿主的主要病理危害；另一部分流入肠系膜，引起宿主肠道炎症进而造成组织破溃，最终落入肠腔并随粪

便排出体外，造成血吸虫病的进一步传播[1]。雌虫的性成熟是雌虫产正常卵的前提，因此有关雌虫性发育成熟的研究或将对防控血吸虫病具有重要的意义。

血吸虫雌雄异体，除极个别雌虫长时间感染后会产生对宿主危害极小的非正常卵外[2]，雌虫的生殖发育和产卵需要来自雄虫的持续刺激，但这种刺激并非来源于受精作用[3]。研究发现，单性雌虫感染宿主后，生殖发育基本处于阻遏状态，与再感染雄虫相互合抱后依然能发育为性成熟个体，产正常卵；正常发育的雌虫和雄虫分离后，其成熟的发育状态也会退化为发育阻碍状态，与雄虫再相遇又会发育为成熟状态。早期研究发现，发育阻遏雌虫的卵巢和卵黄腺，尤其是卵黄腺发育不完善[4,5]。为了进一步了解血吸虫雌虫的生殖发育，本研究对感染后25 d的混合感染雌虫（mixed-sex infection female, MSIF）和单性感染雌虫（single-sex infection female, SSIF）进行了多方面的细致观察，并采用原位末端转移酶标记法（terminal deoxynucleotidyl transferase nice and labeling, TUNEL）对两者卵黄腺细胞的凋亡状态进行了检测。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器甲醛、乙醇、冰醋酸混合（FAA）固定液的配制：48%无水乙醇、10%甲醛、2%冰醋酸、40%去离子水；盐酸卡红染液的配制：取4 g卡红粉溶于盐酸蒸馏水中边加热边搅拌至沸腾，再加入85%乙醇 95 mL，冷却后过滤加氨水调 pH 至7.0备用；透射电镜的样本固定液为PBS配制的2.5%戊二醛溶液；DAPI（货号：40011）为美国Biotium公司产品；盐酸卡红（国药71009382）；凋亡检测试剂盒（promega，G3250，美国）；4%多聚甲醛（鼎国，ARO211）；激光共聚焦显微镜（Nikon C1Si）；透射电子显微镜（FEI T12）；普通光学解剖镜（Olympus SZX 10）。

1.2 实验动物和钉螺 BALB/c（6周龄）小鼠购自上海斯莱克实验动物有限公司；日本血吸虫中国大陆株尾蚴由中国农业科学院上海兽医研究所血吸虫研究室提供。以腹部贴片法感染日本血吸虫尾蚴，为保证有单性感染雌虫，每1只小鼠仅感染来于1个钉螺释放的尾蚴。分别于感染后25 d剖杀，以肝门静脉灌注法收集虫体，获得虫体后随机挑选出雌虫，立即进行普通光学显微镜下拍照。充分洗涤后分别于FAA固定液、2.5%戊二醛、4%多聚甲醛中固定，以用于各项试验；对于合抱虫体待其在冰水混合PBS中自行分离后挑出雌虫固定备用。

1.3 激光共聚焦标本制备及观察参考文献[6]，将虫体放入 FAA 固定液中过夜充分固定后，取出虫体后在盐酸卡红染液中染色12 h左右，然后用 0.5%盐酸乙醇脱色，虫体分别经 70%、80%、90%、100%梯度乙醇脱水。脱水后虫体依次经过等体积无水乙醇及二甲苯混合液、纯二甲苯透明。虫体移至载玻片，滴适量中性树胶，盖上盖玻片封固，平放晾干。用激光共聚焦显微镜观察，发射波长为488 nm，扫描激发值为78%，图像保存为512×512像素类型。

1.4 透射电子显微镜观察卵黄腺将固定于2.5%戊二醛溶液的虫体取出，采用常规超薄切片制作方法制作切片，切片厚度约为70 nm。具体操作：样本清洗→锇酸固定→梯度脱水→丙酮置换→浸渍→包埋→聚合→修块和超薄切片→铀染→铅染，处理后在透射电子显微镜下观察。在切片过程中，横切位置为单一虫体的后2/3位置，此处为混合和单性感染雌虫卵黄腺所在位置。

1.5 TUNEL 法观察卵黄腺凋亡现象将4%多聚甲醛溶液固定虫体用于石蜡包埋并切片，切片厚度5 μm。按照DeadEndTMFluorometric TUNEL （Promega，G3250，美国）试剂盒的操作步骤进行脱蜡、洗涤、通透、荧光染色标记，终止反应后洗涤，用10 μg/ mL DAPI室温孵育10 min后，用新鲜的去离子水室温洗涤3遍，每次5 min。加抗荧光淬灭剂后封片并在激光共聚焦显微镜下观察，观察样品时各项参数及激发光选择按照试剂盒要求设置。

2 结果

2.1 普通光学显微镜下全虫形态结果见图1。图中个体较小虫体为SSIF，个体较大的为MSIF。SSIF无法观察到膨大的卵巢；两者肠管均十分明显，MSIF肠管更发达。MSIF消化道和卵巢光镜下十分明显，

卵巢已经处于雌虫中间部分。SSIF相对MSIF个体形态差别十分明显，且未见明显的卵巢。

2.2 卵黄腺和卵巢激光共聚焦观察在MSIF中可见卵巢中既有成熟的卵细胞也有不成熟的卵细胞，不成熟的卵细胞排列紧密，界限不清晰，而成熟的卵细胞体积大，细胞间界限清晰，细胞呈近似球状，细胞中间可见一亮点（细胞核）。在SSIF感染中，卵巢十分小，其中未见成熟的卵细胞，所有细胞均呈现为一圆亮点，细胞间界限不明显（图2）。两者的卵黄腺，同样有着明显的差异，MSIF可见靠近表皮处有着颗粒状，排列紧密但界限明确的成熟细胞，而SSIF无法观察到颗粒状的成熟细胞，如卵巢一样只能看到界限不明晰的亮点，即无法观察到成熟的卵黄腺细胞。所观察结果与文献[7]报道相符。

2.3 卵黄腺透射电镜观察MSIF卵黄腺细胞（图3 A）贴近基膜处细胞细胞核核仁十分明显，卵黄腺细胞中还观察到明显的卵黄滴（Vd），里面有数十个卵黄球（图3 B）；而SSIF卵黄腺细胞贴近基膜处细胞细胞核核仁（Nu）不明显，同时在卵黄腺中仅发现形成囊泡的脂滴，没有发现形成囊泡的卵黄滴。2.4 TUNEL凋亡检测结果 在对卵黄腺切面的观察中，两个样本的凋亡观察均不是十分明显，整个切面仅能观察到数个不等的绿色荧光点（图4）。部分切片甚至没有观察到绿色荧光点（图片未呈现）。

3 讨论

早期研究表明，单性感染雌虫由于缺乏来自雄虫的刺激而维持在性发育阻遏状态。Serah等[8]通过对曼氏血吸虫雌虫卵黄腺细胞的分化和凋亡观察，认为SSIF的滞育是由于卵黄腺细胞的凋亡造成的，但其卵黄腺细胞的分化则与MSIF并无显著差异。此研究结论与Den等[9]早期对MSIF与SSIF虫体DNA合成情况的比较研究结果不同。Den等[9]研究发现单性感染的滞育雌虫的DNA合成显著低于性发育正常雌虫，即SSIF雌虫卵黄腺细胞的分化程度显著低于MSIF。本研究利用TUNEL法，对正常生理状态的SSIF和MSIF虫体卵黄腺的凋亡水平进行观察比较，结果发现二者凋亡水平均不明显，且二者间并不存在明显的凋亡状态的差异，此结论与Serah等[8]观点相左。血吸虫正常发育雌虫为维持每日大量产卵的需求，需大量卵黄细胞持续不断地产生与成熟（每个虫卵需由一个受精卵细胞及约20个卵黄细胞配备而成），大量卵黄细胞的产生和成熟必然伴随DNA的大量合成。同时，滞育雌虫由于不需要形成大量的成熟的卵黄细胞，其DNA合成水平低下在情理之中，在没有大量卵黄细胞的形成前提下，自然也无需进行大量的凋亡消耗掉这些细胞，这也符合生命活动的最有效性，我们的观察也佐证了此点。

卵黄细胞的发育过程分为四个时期，在细胞成熟的过程中最为明显的变化是形成卵黄滴，而脂肪酸是卵黄滴的主要成分[4]。脂肪酸是雌虫卵黄腺的重要能量来源，它不仅为雌虫卵黄腺细胞的成熟提供营养支持，还能够为卵黄细胞在虫卵中发挥作用提供大量的能量储备，因此脂滴的形成对产生正常虫卵有十分重要的作用[10]。本研究通过对雌虫及其卵黄腺细胞形态的观察发现：滞育雌虫的卵黄腺及其卵巢均未得到良好的发育，MSIF的卵黄细胞内形成了明显的卵黄滴，而SSIF的卵黄细胞内虽也有呈一定程度聚集的脂滴，但并未形成典型的囊泡状的卵黄滴。透射电镜也发现，SSIF虫体卵黄细胞不具备成熟细胞的特征，具体表现在核仁的形态上。核仁与蛋白合成密切相关，核仁状态一定程度上反应了细胞的代谢活动[11]。代谢活动强，蛋白合成能力强的细胞核仁明显，而多处于静止期的细胞如肌细胞等核仁则不明显[12]。CLMS结果也表明SSIF虫体在卵巢和卵黄腺中，不存在类似于MSIF的成熟细胞。由此可见，SSIF的卵黄细胞绝大部分处于不成熟状态，其代谢活动较弱，未进行充分的发育；同样的情况也表现于卵巢，SSIF卵巢也无发育成熟的卵细胞，这也说明滞育雌虫处于待成熟状态。

血吸虫正常发育雌虫产生大量虫卵是血吸虫造成宿主病理损害和血吸虫病传播的关键，血吸虫生殖发育机理的研究有可能对揭示血吸虫性成熟机制及研制抗血吸虫生殖疫苗或药物提供重要理论依据。本研究从形态和结构上简单比较了MSIF和SSIF的差异，为后续MSIF和SSIF发育差异机制研究提供了形态学方面的基础。

[1] Grevelding C G. Schistosoma [J]. Curr Biol, 2004, 14(14): 545.

[2] Shaw J R, Erasmus D A. Schistosoma mansoni: an examination of the reproductive status of females from single sex infections [J]. Parasitology, 1981, 82(1): 121-124.

[3] Basch P F, Basch N. Intergeneric reproductive stimulation and parthenogenesis in Schistosoma mansoni [J]. Parasitology, 1984, 89 (2): 369-376.

[4] Erasmus D A. Schistosoma mansoni: development of the vitelline cell, its role in drug sequestration, and changes induced by Astiban [J]. Exp Parasitol, 1975, 38(2): 240-256.

[5] Popiel I, Cioli D, Erasmus D A. The morphology and reproductive status of female Schistosoma mansoni following separation from male worms [J]. Int J Parasitol, 1984, 14(2): 183-190.

[6] 张薇娜, 黄大可, 张鹏, 等.日本血吸虫成虫生殖系统的激光共聚焦显微镜形态学观察[J]. 中国寄生虫学与寄生虫病杂志, 2008, 26 (5): 392-394.

[7] Neves R H, de Lamare Biolchini C, Machado-Silva J R, et al. A new description of the reproductive system of Schistosoma mansoni (Trematoda: Schistosomatidae) analyzed by confocal laser scanning microscopy [J]. Parasitol Res, 2005, 95(1): 43-49.

[8] Galanti S E, Huang S C, Pearce E J. Cell death and reproductive regression in female Schistosoma mansoni [J]. PLoS Negl Trop Dis, 2012, 6(2): e1509.

[9] Den Hollander J E, Erasmus D A. Schistosoma mansoni: DNA synthesis in males and females from mixed and single-sex infections [J]. Parasitology, 1984, 88 (3): 463-476.

[10] Huang S C, Freitas T C, Amiel E, et al. Fatty acid oxidation is essential for egg production by the parasitic flatworm Schistosoma mansoni [J]. PLoS Pathog, 2012, 8(10): e1002996.

[11] Emmott E, Hiscox J A. Nucleolar targeting: the hub of the matter [J]. EMBO Rep, 2009, 10(3): 231-238.

[12] 翟中和, 王喜忠, 丁明孝. 细胞生物学 [M]. 3版. 北京: 高等教育出版社, 2007: 355.

MORPHOLOGY AND APOPTOSIS OF FEMALE SCHISTOSOMA JAPONICUM FROM SINGLE-SEX AND MIXED-SEX INFECTIONS

HAN Yu, QIAO Hong-bin, CAO Yu-fan, LU Ke, LI Hao, LIU Jin-ming, LIN Jiao-jiao, JIN Ya-mei
(Key Laboratory of Animal Parasitology, Ministry of Agriculture, Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

It is well known that there are striking differences between female worms from single-sex infection or mixed-sex infection. In the present article, the differences in the ovary and vitelline glands of female worms were observed under confocallaser scanning microscopy (CLMS) and transmission electron microscopy(TEM). The terminal deoxynucleotidyl transferase nick end labeling (TUNEL) was also used to detect the vitelline’s apoptosis of those female worms. The CLMS results showed the signif cant differences in size, morphology and cell mature status of ovary and vitelline glands between mixed-sex infection females and single-sex females. In addition, TEM results revealed obvious nuclei and lipid droplets in vetelline glands from mixed-sex infected females but not in single-sex infected females. The apoptosis of vitelline glands were not obvious in both single-sex and mixed-sex infected females. In conclusion, single-sex and mixed-sex infected female worms differed in their size and morphology as well as in cellular status and subcellular structure.

Mixed-sex infection; single-sex infection; morphology; apoptosis; Schistosoma japonicum

S852.735

A

1674-6422（2015）03-0030-06

2015-01-26

中央级公益性科研院所基本科研业务费项目(2013JB17)作者简介：韩愉，男，硕士研究生，预防兽医学专业

金亚美， E-mail: yameijin@shvri.ac.cn