应用抑制性差减杂交筛选鸭疫里默氏杆菌强弱菌株基因组的差异片段

俞 慧，邢林林，祁晶晶，倪欣涛，姜 盼，孙冰清，崔俊生，欧长灿，于圣青，胡青海

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

·研究论文·

应用抑制性差减杂交筛选鸭疫里默氏杆菌强弱菌株基因组的差异片段

俞 慧，邢林林，祁晶晶，倪欣涛，姜 盼，孙冰清，崔俊生，欧长灿，于圣青，胡青海

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）

为了分析鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）强毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因组之间的差异基因，以HXb2株基因组为待测菌株，以NJ-1株基因组为驱动菌株，构建了两株细菌基因组间的抑制性差减文库。经过dot-blot杂交和PCR验证，共鉴定到34个强弱毒株基因组差异片段。测定的序列经BLAST、DNAStar和PSORTb分析，结果表明有2个片段所在基因编码的蛋白为外膜蛋白，有2个片段所在基因编码的蛋白为胞质膜蛋白如磷酸盐转运蛋白，11个片段所在基因编码的蛋白为胞内蛋白如丙氨酸脱氢酶、β-内酰胺酶及一些假定蛋白等，有19个片段所在基因编码的蛋白（大部分为假定蛋白）定位未知。这些差异基因编码的蛋白可能与鸭疫里默氏杆菌的毒力及HXb2株特异蛋白等有关。本研究为下一步鉴定新的毒力基因及其他特异蛋白的功能奠定了基础。

鸭疫里默氏杆菌；抑制性差减杂交；基因组差异

鸭疫里默氏杆菌感染又称鸭传染性浆膜炎，是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer, RA）感染鸭、鹅、火鸡等引起的一种高致病性、接触传染性疾病。该病呈急性或慢性败血症形式，其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、干酪性输卵管炎和脑膜炎[1]，可引起病鸭消瘦、胴体淘汰、品质下降以及高死亡率，从而造成巨大的经济损失[2]。目前报道的血清型至少有21种[3]，而且不同血清型之间交叉保护性低[4]。

目前对鸭疫里默氏杆菌的致病机制和毒力相关基因还知之甚少，已经确定的毒力相关因子有外膜蛋白 OmpA[5]、TbdR1[6]、SIP[7]、TonB1和TonB2[8]。另外，还推测一些因子可能与致病性相关，如pCFC1 质粒中含有两个毒力相关基因 VapD1 和VapD2，以及 CAMP 溶血素等[9]。

鉴定强毒株与弱毒株株基因组差异对于分析鸭疫里默氏杆菌菌株遗传分化关系、毒力变异、分子流行病学分析等方面具有较高的应用价值。本研究采用抑制性差减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH）的方法，构建了RA强毒力菌株与弱毒力菌株之间遗传差异表达基因文库。

1 材料与方法

1.1 菌株、培养基和试剂鸭疫里默氏杆菌强毒菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1由本实验室保存，所有RA菌株均用胰酶大豆肉汤（TSB）培养基37℃振荡培养，或TSA平板置5%CO2培养箱中37℃培养；胰酶大豆肉汤（TSB）培养基购自德国MERCK公司；大肠杆菌（DH5α）购自北京天根生化科技有限公司；抑制性差减杂交试剂盒购自Clontech公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司；地高辛探针标记与检测试剂盒购自Roche公司；限制性内切酶Rsa I、Taq酶购自Promega公司。

1.2 细菌基因组DNA的制备取-80℃冻存的RA菌株HXb2和NJ-1，分别涂布TSA平板，在5% CO2培养箱37℃过夜培养。用无菌TSB洗下平板上的细菌，采用细菌基因组DNA提取试剂盒（北京天根）分别提取2株细菌的基因组DNA，然后用Nanodrop微量分光光度计测定浓度。

1.3 抑制性差减杂交（SSH）以RA菌株HXb2为待测菌株（tester），以NJ-1为驱动菌株(driver)，将其基因组DNA分别用RsaⅠ酶进行消化。待测菌株HXb2 的DNA分为两部分，分别连接不同接头，按照Clontech公司差减杂交试剂盒说明书进行连接效率分析。利用接头外侧序列引物、23S rRNA正向引物及23S rRNA反向引物分别对大肠杆菌23S rRNA进行PCR扩增。确定连接效率以后，进行差减杂交。第1次杂交中，将酶切后的过量驱动菌株NJ-1 DNA分别加至两种接头连接后的待测菌株HXb2 DNA样品中，样品变性后在63℃杂交1.5 h。第2次杂交中，将以上两个杂交样品混合，加入新的变性驱动菌株NJ-1 DNA，63℃杂交过夜。杂交后的产物加入根据连接接头设计的引物，进行2次PCR扩增，所得的PCR产物即为差减后的基因组片段。PCR产物纯化后与pGEM-T Easy载体相连接，转化于DH5α感受态细胞中，用含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB琼脂平板筛选阳性克隆，建立抑制性差减杂交文库。

1.4 斑点杂交用地高辛分别标记的HXb2株和NJ-1株基因组DNA经RsaⅠ酶切后的产物作为探针，标记方法按地高辛标记试剂盒说明书进行。再将用PCR扩增白斑单克隆菌中T载体中插入的片段，在尼龙膜上进行点杂交，以鉴定差减片段的特异性。

1.5 测序根据斑点杂交的结果，将对应的含阳性克隆质粒的细菌克隆挑出，送上海英潍捷基公司完成测序工作。用BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）和DNAStar 软件（DNAStar Inc., Madison, WI, USA）进行序列同源性等分析。

1.6 差异片段的PCR鉴定根据SSH后得到的差异片段序列设计引物，分别以RA菌HXb2株和NJ-1株为模板，进行常规PCR扩增[10]，鉴定该差异片段是否仅存在于HXb2株基因组中，NJ-1株基因组中没有。

2 结果

2.1 基因组提取、酶切结果分析提取的RA HXb2和

NJ-1的基因组经分光光度计测定，其OD260/OD280均为1.87，浓度分别为312.4 μg/μL和296.1 μg/ μL，证明基因组中蛋白质和RNA污染较少，基因组纯度较高。琼脂糖凝胶电泳显示基因组条带完整清晰，无降解。RsaⅠ酶切后进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果显示在0.1～2 kb之间呈拖带状（见图1），可见酶切完全。

2.2 差异片段的多样性鉴定差减后的PCR产物经纯化后与pMD18-T 载体连接，转化后挑选阳性克隆用SSH试剂盒中的巢式PCR引物1/引物2R进行菌落PCR鉴定。结果显示，扩增的产物大小分布不一，呈现多样性，大小在0.25～1.1 kb之间（图2），可见构建出来的差减文库具有良好的多样性。

2.3 强弱菌株差异片段的筛选斑点杂交结果见图3，根据杂交信号初步筛选到60个可能的强弱菌株差异基因片段。根据其序列设计引物，进一步常规PCR验证其在HXb2中的特异性。结果筛选到了34个HXb2与NJ-1株的差异基因组片段。

2.4 差异基因片段的序列分析将获得的34个阳性克隆进行测序并将测序结果递交GenBank 进行同源性分析(表1)。用PSORTb Subcellular Localization Prediction Tool（http://www.psort.org/psortb/）在线软件分析差异基因编码蛋白的定位。

3 讨论

SSH由Diatchenko等[11]1996年首次报道，是抑制PCR与差减杂交技术相结合的更简单更快速的分离差异基因的方法。它应用抑制性PCR原理，利用两种接头，选择性扩增差异表达的靶片段，抑制非靶片段的扩增。该技术目前已广泛应用于差异基因的快速筛选，为微生物基因功能研究提供有力手段。Akopyants等[12]首次证实SSH可用来筛选细菌特异性序列。本研究采用SSH方法来筛选RA强毒

菌株HXb2和弱毒菌株NJ-1基因组的差异片段。

通过PCR验证，在60个片段中鉴定到34个HXb2特异性差异片段。依据其所在基因编码蛋白的定位可进行如下分类：（1）片段所在的基因编码细胞外膜蛋白。17#为氯高铁血红素受体的基因片段，氯高铁血红素受体能与血红素特异性的结合，使细菌能从外部环境中摄取铁元素。铁是细菌生命活动必须的营养元素，在生物代谢过程中起着非常重要的作用，虽然宿主体中含铁元素丰富，但绝大部分与转铁蛋白（主要是血红素）和乳铁蛋白结合在一起。有研究表明细菌在宿主体内能否获取充分的铁是决定病原菌能否突破宿主天然免疫系统，造成感染的重要原因[14]。片段9#与patatin样磷脂酶（patatinlike phospholipase, PNPLA）具有同源性，PNPLA家族的蛋白都具有patatin结构域，该结构域包括丝氨酸-天冬氨酸催化三联体的酶活性部位和底物结合区域两个重要组成部分[15]，并可通过不同方式分泌至胞外并发挥表面抗原功能。2003年Sato等[16]在铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）中发现一个具有磷脂酶活性的毒力因子ExoU，与patatin存在较高的同源性，其是否与RA毒力相关有待进一步研究。另外，片段1#编码的是与硫胺素合成有关的膜连脂蛋白，与片段5#编码的ApbE样蛋白有很高的同源性。ApbE是鼠伤寒沙门氏菌的一种脂蛋白，与硫胺素的合成有关[17]。（2）差异片段所在的基因编码一些酶类和蛋白：33#编码糖基转移酶，而糖基转移酶是糖基化过程的关键酶，根据功能预测可能与脂多糖（LPS）合成有关，LPS是革兰阴性菌细胞壁外膜中的组成成分，是内毒素和重要群特异性抗原，它能在细菌周围形成一层保护屏障以逃避抗生素的作用，并作用于宿主细胞，诱导IL、TNF等细胞因子的释放，在革兰阴性细菌致病过程中起重要作用；片段6#编码蛋白属于核酸甲基转移酶，其功能与核糖体代谢相关；片段18#和21#编码的丙氨酸脱氢酶和谷氨酰胺酰-tRNA合成酶参与细胞代谢和蛋白质的合成，20#编码的蛋白二硫键还原酶和30#编码的磷酸盐转运蛋白属于胞质膜蛋白，磷酸盐转运蛋白是普遍存在于细菌中参与磷酸盐转运过程的一个重要家族的转运蛋白。（3）一些差异片段所在的基因编码假设蛋白或功能未知的蛋白，其表达的蛋白及功能有待进一步分析。（4）差异片段中还有一些是基因组中的可移动成分。如27#和29#是IS4插入序列转座酶，31#是IS1插入序列部分片段，可能参与外源基因或片段的水平转移。

另外，根据差异片段在CH-2基因组中的位置的对比，可以发现1个分布相对集中的区域，长度为304 kb左右，片段数为15个。其中有1个片段编码的是与硫胺素合成有关的膜连脂蛋白；另1个片段编码β-内酰胺酶，与细菌的耐药性有关，β-内酰胺酶的产生是革兰阴性细菌对青霉素、头孢霉素等β-内酰胺类抗菌药物耐药的主要机制之一；另2个片段编码为丙氨酸脱氢酶和ATP酶；其他还包括插入因子insA、代谢蛋白、DNA修饰限制系统特异位点I型以及若干假定蛋白。推测该集中区域可能为HXb2株外源基因插入的热点区域，需要进一步研究证实。

本研究成功构建了HXb2和NJ-1株基因组的的差减文库，为进一步鉴定鸭疫里默氏杆菌的毒力相关基因、探索强毒株和弱毒株之间差异的分子基础等奠定了重要基础。

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IDENTIFICATION OF GENOMIC DIFFERENCES BETWEEN VIRULENT AND ATTENUATED RIEMERELLA ANATIPESTIFER STRAINS USING SUPPRESSION SUBSTRACTIVE HYBRIDIZATION

YU Hui, XING Lin-lin, QI Jing-jing, NI Xin-tao, JIANG Pan, SUN Bing-qing, CUI Jun-sheng, OU Chang-can, YU Sheng-qing, HU Qing-hai
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

To analyze the genomic differences between highly pathogenic strain HXb2 and low pathogenic strain NJ-1 of Riemerella anatipestifer, suppression subtractive hybridization (SSH) was performed using HXb2 genome as tester and NJ-1 genome as driver. After examination in the dot-blot and PCR, 34 differential fragments were identified. Sequence analysis with softwares BLAST, DNAStar and PSORTb showed that 2 differential genes coding for membrane protein, 2 genes for cytoplasmic membrane protein such as phosphate transporter and 9 genes for intracellular proteins such as alanine dehydrogenase, beta-lactamase and some hypothetical protein. In addition, the locations of proteins (mostly hypothetical proteins) encoded by other 19 differential genes were unknown. The proteins encoded by these differential genes might be related to the virulence of HXb2, or HXb2-specif c proteins, etc. This study laid the groundwork for further identifying new virulence factors and studying the functions of the HXb2- specif c proteins.

Riemerella anatipestifer; suppression subtractive hybridization (SSH); genomic differences

S852.612

A

1674-6422（2015）03-0024-06

2014-12-31

国家自然科学基金(31272590, 31472224)

俞慧，女，硕士研究生，预防兽医学专业

胡青海，E-mail: hqh@shvri.ac.cn