miR-208和miR-499与心血管病研究进展

miR-208和miR-499与心血管病研究进展

陈耽李骊华

(重庆医科大学附属第一医院心血管科，重庆400016)

关键词〔〕miR-208；miR-499；心血管病

中图分类号〔〕R54〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家临床重点专科建设项目经费资助(No.财社〔2011〕170号)

通讯作者：李骊华(1970-)，女，博士，硕士生导师，主要从事冠心病动脉粥样硬化研究。

第一作者：陈耽(1990-)，男，在读硕士，主要从事冠心病缺血心肌保护研究。

microRNA(miRNA)是一类由20~25个核苷酸组成的在进化上高度保守的内源性小分子单链非编码RNA。主要通过与靶mRNA的3′-非编码区(3′-UTR)的特异性序列碱基互补配对结合，产生转录后抑制，从而调控基因的表达〔1〕。miRNA在高等生物生命活动中扮演重要角色，参与生物细胞增殖、分化、免疫、应激、凋亡、癌变等多种生命过程，并在肿瘤发生及心血管病等各种疾病中起到至关重要的作用。

1miR-208、miR-499与MyomiRs家族

MyomiRs家族即肌球蛋白基因内含子编码的miRNA家族，包括miR-208a、miR-208b、miR-499，其编码基因分别位于(Myh)6/a组织相容性复合体(MHC)、Myh7/βMHC、Myh7b的内含子内。并反过来调节肌球蛋白基因表达和肌肉对生理病理信号的反应〔2〕。在生长发育不同阶段其表达不同，β-MHC/miR-208b在胎儿小鼠心脏高表达，而随着小鼠发育表达下降，成年小鼠几乎不表达；而a-MHC/miR-208b正好相反，在胎儿小鼠几乎不表达，随着小鼠发育表达增加，成年小鼠达高峰；myh7b/miR-499则一直保持较高水平。且miR-208a具有心脏特异性，几乎只在心脏表达，而miR-208b和miR-499在心脏和骨骼肌均有表达〔3〕。人类myh6和myh7基因串联在染色体14 q12上，miR-208a和miR-208b具有大量相同的重复序列，且miR-208在物种间具有高度保守性。

miR-208a对β-MHC/miR-208b和myh7b/miR-499的表达具有上游调控作用，miR-208不仅调控在应激和甲状腺功能减退时β-MHC/miR-208b的表达，也调控myh7b/miR-499在成人心脏的表达。在miR-208a-/+成年小鼠心脏myh7b和miR-499的表达下降50%；而在miR-208a-/-成年小鼠心脏myh7b和miR-499几乎不表达。此外，在miR-208a-/-小鼠心脏强制表达miR-499时足以激活β-MHC/miR-208b 的表达及抑制快肌基因的异位表达，这表明miR-499是miR-208a发挥作用的一个下游效应介质〔2〕。肌球蛋白基因不仅编码主要的肌肉收缩蛋白，同时通过内含子中MyomiRs家族的miRNA网络控制肌肉的基因表达和性能，在心血管系统发挥重要的作用。

2miR-208a

人类miR-208a的编码基因位于第14号染色体上的a-MHC基因的第27个内含子内。

2.1miRNA-208a与心肌肥厚van Rooij等〔3〕研究发现miR-208是心肌肥厚、纤维化的重要调控因子。在应激和甲状腺功能减退的情况下miR-208通过与甲状腺素受体相关蛋白(Thrap1)靶基因的3′-UTR结合，转录后抑制Thrap1表达，从而使β-MHC表达增加，进而促进心肌肥厚和心肌纤维化。此外，Montgomery等〔4〕还推断miR-208通过调节多种β-MHC转录抑制因子如Sox 6、Purβ、Sp3和 HP1β的表达，使β-MHC上调。

Callis等〔5，6〕发现，miR-208实际上是肌球蛋白miRNA家族中的一员，分miR-208a和miR-208b两个亚型。在心脏超表达会诱发心肌细胞(CMs)增生性生长，并发现除Thrap1 外，miR-208a还以肌肉生长抑制素基因(myostatin)为靶标，负性调节心肌的生长和肥大。Montgomery等〔7〕也发现miR-208a通过介导转录阻遏蛋白，调控应激刺激下的心脏基因表达。Thrap1是miR-208a的主要靶标。通过给予miR-208a抑制剂使miR-208a减少，Thrap1表达上调，通过阻断下游的应激应答基因的激活而使β-MHC表达下调，延缓高血压大鼠心功能障碍的进程。表明miR-208a在病理性心脏重塑中起重要作用。

2.2miRNA-208a与心脏传导Callis等〔5〕研究显示，miR-208a过表达容易引起的心律失常，在miR-208a基因敲除小鼠的心电图中，约80%的QRS波前p波消失，表明miR-208a基因敲除小鼠容易发生心房颤动。连接蛋白(Cx)40缺乏易导致心脏传导缺陷，Cx 40的表达仅限于心房和构成希氏束、浦肯野纤维的心肌细胞〔8〕。与野生型相比miR-208a-/-小鼠 Cx 40的转录水平明显下降，表明Cx 40的表达需要miR-208a参与。除了调节Cx 40的表达，miR-208a还可以直接抑制转录因子GATA4和Hop在成人心脏传导系统的表达〔5〕，在miR-208a-/-小鼠心脏GATA4表达上调而Hop表达下调，表明GATA4可能是miR-208a的直接靶标之一，而Hop通路间接受miR-208a调控。并发现与野生型相比miR-208a-/-小鼠Hop通路的转录水平和蛋白表达水平均降低。同时有数据表明〔9〕，Hop直接作为Nkx2.5下游效应元件发挥功能，通过同源重组使Hop失活可导致心肌发育严重缺陷而使部分胚胎致死。

2.3miRNA-208a与代谢Zhang等〔10〕实验发现高浓度胰岛素使得血管平滑肌细胞(VSMC)中miR-208上调，进而促进 VSMC 异常增殖，而抑制miR-208 表达将阻断胰岛素促 VSMC 增殖的作用。而后通过生物信息学预测等方法发现 miR-208可作用于下游靶蛋白 p21，对p21发挥转录后负性调控作用，抑制 p21 表达，提示高浓度胰岛素可通过增加miR-208的表达，间接抑制 p21 表达，进而促进 VSMC 增殖。

Grueter等〔11〕研究发现心脏通过中介因子复合体的亚基中介因子复合体亚基(MED)13控制甲状腺激素和其他核激素受体的转录调节全身能量平衡。MED13又受心脏特异性miRNA，miR-208a的负性调节作用。心肌特异性超表达MED13或通过药物下调miR-208a可使小鼠抵抗高脂饮食诱导的肥胖和改善全身胰岛素敏感性和葡萄糖耐受性。相反，CMs MED13基因缺失将导致高脂饮食诱导的肥胖增强并使代谢综合征加剧。MED13通过增加能源消耗和调控许多基因参与心脏的能量平衡而产生代谢活动。这些研究结果揭示了心脏在控制全身代谢方面的作用并提示MED13和miR-208a可作为治疗代谢紊乱的潜在靶点。

3miR-499

人类miR-499的编码基因位于第20号染色体上的Myh7b基因的第20个内含子内。miR-499一般与Myh7b协同表达，主要表达于心肌及骨骼肌慢肌纤维，其他组织亦有少量表达。研究〔12~18〕发现miR-499在心脏发育、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤，心肌肥厚及心力衰竭等病理生理过程中发挥重要作用。

3.1miR-499与CMs增殖及分化miR-499在心脏的发育分化过程中及正常生理情况下大量表达。Wilson等〔12〕通过微阵列法分析H7人类胚胎干细胞(hESC)源性心肌细胞(hESC-CMs)发现高表达的miR-499使胚体心脏转录因子肌细胞增强因子(MEF)2C显著上调，而MEF2C是心脏收缩基因激活和心脏结构形成的重要转录因子，表明miR-499可能是人类胚胎干细胞特异性分化的重要因子。

Sluijter等〔13〕在体外分离培养胎儿心肌祖细胞(CMCPs)向CMs分化过程中，检测到肌肉特异性miR-499显著上调。通过瞬时转染miR-499后发现CMCP的增殖率下降了15%，但增强了CMCP和hESC向成熟心肌细胞的定向分化。显示miR-499可通过抑制Sox 6，使Sox 6蛋白含量减少和小干扰核糖核酸(siRNA)介导的Sox 6沉默，强烈诱导CMCPs肌源性分化。

Zhang等〔14〕通过构建miR-499慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞发现，miR-499增加心脏的特定基因Nkx2.5、GATA4、MEF2C、心肌肌钙蛋白(cTnI)的表达，降低β-catenin的磷酸化/去磷酸比率进而激活Wnt/β-catenin信号通路，诱导大鼠骨髓间充质干细胞向CMs分化。

Hosoda等〔15〕发现miR-499也影响人心肌干细胞(hCSCs)向成熟CMs的分化。miR-499在hCSCs几乎检测不到，但在有丝分裂后的CMs中高水平表达。miR-499可穿过细胞间隙连接通道，并进入到邻近的hCSCs细胞内，通过siRNA抑制Sox 6和rod1靶基因的合成而发挥功能使GATA4和Nkx2.5表达增加进而促进hCSC分化。此外miR-499不仅影响胚胎期CMs分化，在心肌损伤后细胞修复过程中也起着重要作用。体外培养高表达miR-499的hCSCs并注入到动物心肌梗死边缘区，发现梗死区CMs再生及化分明显增加，且心功能明显改善。

3.2miR-499与CMs凋亡心脏的功能是高度依赖于ATP的产生，所以CMs富含大量线粒体，以提供心肌所需的能量。线粒体不断进行融合和裂变以维持细胞器活性。但异常线粒体裂变会参与细胞凋亡的启动，引起心肌梗死中细胞凋亡。线粒体核裂变需要动力相关蛋白(DRP)1的参与，使线粒体外膜分裂，从而使线粒体管裂变成片段〔16〕。Wang等〔17〕发现在心肌缺血等病理条件下miR-499水平明显下调，考虑miR-499可能参与调节CMs凋亡。进一步研究发现，钙调磷酸酶催化亚基(CnA)a 和CnAβ蛋白是miR-499的直接靶标，miR-499通过抑制钙调磷酸酶介导CRP1脱磷酸化，减少CRP1在线粒体累积和CRP1介导的线粒体裂变程序激活进而抑制CMs凋亡。

还通过分析miR-499的启动子区域，发现2个典型的P53的转录因子结合位点，P53基因可与这两个转录因子结合位点结合，在转录水平下调miR-499的表达。同时还发现miR-499转基因小鼠心脏重塑和心功能明显改善，如心脏/体重比值，CMs横截面积，胶原含量明显下降。而通过antagomir沉默小鼠 miR-499表达加重有害心脏重塑和缺血再灌注损伤，并伴有胶原沉积增加和心肌肥厚、心室扩大及明显心功能不全。

3.3miR-499与心脏应答Shieh等〔18〕利用转基因表达不同水平miR-499小鼠模型研究发现，miR-499高水平表达可以剂量依赖的方式导致心肌肥厚和心肌病。高水平miR-499可显著下调心脏早期应答基因(Egr)1，Egr2和(Fos)的表达，增加压力负荷诱导心功能障碍的易感性，致小鼠发生自发性心脏收缩功能障碍。同时发现miR-208a基因敲除小鼠miR-499水平下降而Egr1，Egr2 和 Fos水平升高，提示miR-208和miR-499可能共同参与心脏早期应答基因的调控。而早应答基因在心脏对压力负荷应答基因转录层面占重要地位，提示调控miRNA可能是影响高血压或主动脉瓣疾病等压力超负荷过大诱发的心血管疾病进展的重要因素。而在Ikeda等〔19〕研究中在人主动脉瓣狭窄时，miR-499水平明显下降。这种减量调节心脏基因表达的变化可能是一种心脏对压力负荷重要的生理应答。也可能是因为转基因小鼠非正常的miR-499下调扰乱了心脏对压力负荷的正常应答。

4miR-208，miR-499与生物学标志物

Mitchell等〔20〕首次提出miRNA在人类血浆中稳定存在并保有内源性RNA酶活性。使miRNA作为生物学标志物成为可能。

Ji 等〔21〕在用异丙肾上腺素诱导的大鼠心肌梗死模型中发现血浆miR-208的浓度明显增加，其出现的时间窗几乎与肌钙蛋白一致。而后Corsten 等〔22〕对急性心肌梗死(AMI)、病毒性心肌炎、心舒张功能不全及急性心力衰竭4种心脏病患者的血浆miRNA进行分析，发现与对照组相比，AMI患者血浆miR-208b 和miR-499 显著升高，分别上升1 600倍和100倍，并与肌钙蛋白T 和肌酸磷酸激酶(CPK)的升高显著相关；而在病毒性心肌炎患者中则分别升高30倍和6倍。提示心肌受损时miR-208b 和miR-499释放入血增加。Wang等〔23〕在对66例胸痛患者及大鼠心肌梗死模型的研究中发现AMI患者血浆miR-1、-133a、-499和miR-208a水平显著高于健康志愿者、非AMI患者及其他心血管疾病患者。且发现miR-208a具有心肌特异性，几乎只在心脏表达。在90.9% 的AMI患者和100% 的症状发生4 h内的AMI患者血浆中均检测出miR-208a表达，而非AMI几乎检测不到检测不到miR-208a表达。且通过对特征曲线分析提示miR-208a对AMI诊断具有较高的灵敏性及特异性。

Adachi等〔24〕通过miRNA阵列分析发现miR-499也具有心肌特异性，且miR-499在AMI患者血浆表达显著增加，而其他心脏疾病患者和健康受试者则处于较低水平，表明miR-499可能是AMI的生物标志物。

另外少数临床结果显示〔25〕，在扩张型心肌病的心肌miR-208水平升高，提示miR-208可以预测扩张型心肌病患者心力衰竭和心脏猝死事件的发生，可能与人类的扩张型心肌病中胚胎模式基因的重新表达(例如，上调β-MHC)和心肌胶原积累的增加导致不可逆的心肌损伤有关。

综上，miR-208和miR-499同属于MyomiRs家族，在心脏发育、心肌梗死、心肌缺血再灌注损伤、心肌肥厚、心脏电生理传导、心力衰竭及机体代谢等病理生理过程中发挥重要作用，同时也是很好的生物标志物。而随着各种miRNA类似物及antagomirs和agomirs的研发，使miRNA的人为调控成为一种新的治疗手段。通过调控miR-208和miR-499表达，减少心肌肥厚和心肌纤维化并抑制CMs凋亡，同时促进CMs再生和定向分化，也许会为AMI患者提供一种新的治疗策略。但是，目前大部分研究仍处于初期阶段，甚至部分结论只是推断，miR-208和miR-499是否还有其他靶标，部分精细调控机制还有待进一步研究。同时miR-208a对miR-208b和miR-499具有上游调控作用，而miR-499又是miR-208a发挥作用的重要下游效应介质以及其所具有的大量相同的重复序列，它们是否还存在更复杂的调控网络，还有待探索。

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〔2013-12-27修回〕

(编辑赵慧玲/杜娟)