实时聚合酶链锁反应动态监测肺癌患者血清VEGF-R的表达及意义

实时聚合酶链锁反应动态监测肺癌患者血清VEGF-R的表达及意义

陈芳黄文碧周光群1李亚军高晓霞邹彦柏玉举2

(遵义医学院附属医院肿瘤医院三病区，贵州遵义563003)

摘要〔〕目的探讨肺癌患者血清中血管表皮生长因子受体(VEGF-R)的含量及其临床意义。方法以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因作为内参照基因，使用实时聚合酶链反应(RT-PCR)定量方法，动态监测VEGF-R在肺癌患者化疗前、中、后血清中的表达水平。结果33例肺癌患者接受化疗前、化疗中、化疗后的VEGF-R水平存在差异性，两两比较有统计学差异(P<0.05)，VEGF-R表达水平随着化疗的进行逐渐降低(P<0.05)；肺癌患者血清中VEGF-R表达水平与年龄、性别、肿瘤分期均无明显关系(P>0.05)，而低分化程度患者血清VEGF-R表达水平明显高于高分化患者(P<0.05)，腺癌及其他病理其型患者明显高于鳞癌，有淋巴结转移患者高于无淋巴结转移患者(P<0.05)。结论肺癌患者血清中VEGF-R表达水平在化疗前后存在差异性，并且其表达水平与肿瘤分化程度、病理类型和淋巴结转移有关，可作为肺癌患者化疗预后的指标。

关键词〔〕肺癌；VEGF-R；GAPDH

中图分类号〔〕R736〔文献标识码〕A〔

基金项目：遵义医学院硕士启动基金〔院字(2007)49号〕

通讯作者：柏玉举(1969-)，男，硕士，主任医师，主要从事肺癌、食道癌、乳腺癌等恶性肿瘤方面的研究。

1遵义医学院附属医院内镜科

2遵义医学院附属医院肿瘤医院一病区

第一作者：陈芳(1974-)，女，硕士，副主任医师，主要从事头颈、淋巴瘤、乳腺癌等恶性肿瘤方面的研究。

肿瘤生长与转移依赖于血管生长，血管内皮生长因子(VEGF)直接或间接刺激宿主的免疫细胞或基质细胞，促进内皮细胞的增殖与迁移，最终导致血管生长。肿瘤细胞可产生大量VEGF，通过旁分泌作用刺激周围血管生成。现在认为VEGF〔1〕是最重要的促进血管新生的因子之一，起着核心作用的血管形成正调节。本研究通过动态监测肺癌患者化疗前、中、后血浆VEGF受体(VEGF-R)水平，旨在为病情监测、疗效观察及预后判断提供客观指标。

1资料与方法

1.1研究对象选取2011年4月至2012年1月在我院接受治疗的33例肺癌患者，男23例，女10例；年龄36～71岁，中位数52岁；所有患者按病理类型：26例鳞癌，5例腺癌，1例小细胞肺癌，1例支气管镜刷检找到癌细胞；按发病部位：发生于右肺的15例，左肺患者18例；按分化程度：低分化25例，分化程度中等或高的8例；按是否有淋巴结转移：18例淋巴结转移，15例无淋巴结转移；按肿瘤分期：10例Ⅰ、Ⅱ期，23例Ⅲ、Ⅳ期。非小细胞肺癌采用TP方案： 紫杉醇135～175mg/m2静滴(第1天，d1)， 顺铂75 mg/m2(总量分3 d,d1～3)治疗。小细胞肺癌采用EP方案：依托泊苷100 mg/m2静滴(d1～d3)和顺铂25mg/m2(d1～d3)治疗。以上方案21d为1个周期，均需完成4个期治疗。

1.2仪器与主要试剂AllegraX-30R型低温高速离心机购自美国BeckmanCoulter商贸(中国)有限公司，XW-80A型漩涡混合仪购自海门市其林贝雨仪器制造有限公司，普通扩增仪购自德国Eppendorf公司，Mini-6K微型离心机购自珠海黑马医学仪器有限公司，CFX96Real-TimeSystem购自美国Bio-Rad公司。VEGFR及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)引物：上海捷瑞生物工程有限公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒、TRNzol：北京天根生化科技有限公司；焦碳酸二乙酯(DEPC)：上海捷瑞生物工程有限公司；双蒸水(用DEPC处理的)；75%乙醇(用去氨的双蒸水配制)。VEGFR反向引物5'-GGCTCTTTCGCTTACTGTTCTG-3'，VEGFR正向引物5'-CTCTGCCTACCTCACCTGTTTC-3'，GAPDH反向引物5'-CGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT-3'和GAPDH正向引物(5'-GGGCATCCTGGGCTACACTGAG-3')。

1.3方法

1.3.1单个核细胞的分离采静脉抗凝(EDTA)血3ml，加Hank液3ml混匀，然后缓慢加入含有3ml淋巴细胞分离液的试管上层，2 000r/min离心15～20min，取中间白色条带层(单个核细胞)，用磷酸盐缓冲液(PBS)反复洗涤3次(800r/min离心5min)悬浮于1mlTRNzol液(-85℃保存)。

1.3.2提取总RNATRNzol1ml+107/ml单个核细胞(组织块超声粉碎)→混匀→冰上5 min(不时振荡呈黏稠状)→加氯仿200 μl→混匀→ 13 000 r/min(4℃)离心10 min→取上清→加入500 μl(与上清等量)异丙醇→混匀→冰上静置10 min→13 000 r/min离心10 min→弃上清→加入70%乙醇(DEPC水配)700 μl→ 13 000 r/min离心2 min(2次)→尽量弃上清→室温倒置干燥→用DEPC水溶解后取5 μl进行逆转录(用紫外测纯度及含量)。

1.3.3逆转录DNA根据逆转录试剂盒说明操作。

1.3.4荧光定量PCR扩增〔2〕25μl反应体系：2.5×RealMasterMix/20×SYBRsolution11.25μl，上下游引物2μl，模板2μl，无菌超纯水9.75μl。扩增条件为95℃ 2min(预变性)，95℃ 20s(变性)，52℃ 30s(退火) 40个循环，72℃ 10min，扩增后4℃保存。

1.4统计学方法应用SPSS17.0软件多组之间的均值比较采用方差分析，两两比较采用LSD法、t检验。

2结果

2.1肺癌患者化疗前后VEGF-R水平变化在化疗前、中、后VEGF-R水平(28.85±1.65、21.47±3.25、15.41±3.59)存在差异，并且两两之间有统计学差异(P<0.05)，VEGF-R表达水平随着化疗的进行逐渐降低(P<0.05)；化疗前、中、后的VEGF-R/GAPDH比值(1.43±0.17、1.11±0.21、0.82±0.33)差异显著(P<0.05)。化疗前、中、后的GAPDH水平(20.36±2.11、19.55±2.09、19.39±2.73)无统计学差异(P>0.05)。

2.2肺癌患者化疗前VEGF-R水平与可能影响因素的关系肺癌患者血清中VEGF-R表达水平与年龄〔≥60岁组(1.52±0.19)vs<60岁组(1.41±0.17)〕、性别〔男(1.45±0.19)vs女(1.42±0.16)〕、肿瘤分期〔Ⅰ、Ⅱ期(1.44±0.18)vsⅢ、Ⅳ期(1.42±0.17)〕均无明显关系(P>0.05)，而低分化程度患者血清VEGF-R表达水平明显高于高分化患者〔(1.57±0.21)vs(1.37±0.12)，P<0.05〕，腺癌及其他病理类型患者明显高于鳞癌〔(1.48±0.19)vs(1.32±0.14)，P<0.05〕，有淋巴结转移患者高于无淋巴结转移患者〔(1.54±0.22)vs(1.40±0.16),P<0.05〕。

3讨论

VEGF对于肿瘤的发生、发展、侵袭过程有着关键性的作用。有研究表明〔2～4〕，在肿瘤形成早期，由于肿瘤组织低氧环境、代谢性应激的诱导以及癌基因激活，打破成熟血管休眠期，上调促血管新生因子表达，引发血管新生。血管新生不仅在修复、生长、繁殖等过程中起着决定性作用，同时对肿瘤的形成、转移及其他许多非肿瘤疾病起至关重要的作用。VEGF-R及其配体表皮生长因子(EGF)在癌症进展过程中的肿瘤细胞增殖，凋亡，转移，血管新生等过程起关键地位。本研究结果说明VEGF-R水平可能揭示化疗疗效。这与以往关于VEGF-R的研究结果相似〔5〕，VEGF-R的表达水平可能参与肺癌细胞的增殖，与肺癌的发生、发展有关，可作为肺癌早期诊断及预后的分子标志物。有研究报道〔6〕，血清中VEGF-R表达水平可作为一个影响肺癌进展的重要因子。

综上所述，动态监测肺癌患者血清中VEGF-R表达水平，不仅能够较好地反映肿瘤的侵袭、转移能力，可以判断肿瘤的恶性程度，是反映淋巴结转移和癌灶转移的指标之一，而且可作为判断肺癌患者病情进展的指标，便于指导临床分期、用药及在影像学资料确诊前发现转移的早期指标。

4参考文献

1HataK,WatanabeY,NakaiH,et al.Expressionofthevascularendothelialgrowthfactor(VEGF)geneinepithelialovariancancer:anapproachtoanti-VEGFtherapy〔J〕.AnticancerRes,2011;31(2):731-7.

2冯梅,向继洲,刘慧.肾性高血压大鼠心肌和血管表皮生长因子受体的表达〔Z〕.中国山东济南:20112.中国药理学会第十一次全国学术会议专刊.

3蔡开灿.非小细胞肺癌术后EGFR基因状态对化疗、靶向治疗疗效影响的临床研究〔D〕.广州：南方医科大学,2013.

4WangL,ZhangD,ChenXR,et al.Expressionofvascularendothelialgrowthfactor(VEGF)andVEGF-CinserumandtissueofWilmstumor〔J〕.ChinMedJ(Engl),2011;124(22):3716-20.

5GershteinES,KushlinskyDN,LevkinaNV,et al.RelationshipbetweentheexpressionofVEGFsignalcomponentsandmatrixmetalloproteinasesinovariantumors〔J〕.BullExpBiolMed,2011;151(4):449-53.

6魏杨辉.Galectin-3siRNA和pIRES-IL-24-TRAIL的构建及其对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响〔D〕.广州：南方医科大学,2013.

〔2015-03-22修回〕

(编辑袁左鸣)