海南省关节炎和神经系统疾病患者莱姆病调查

朱 雄，张 琳，侯学霞，耿 震，陈 海，陈 婷，俞书义，郝 琴

海南省关节炎和神经系统疾病患者莱姆病调查

朱 雄1，张 琳2，侯学霞2，耿 震2，陈 海1，陈 婷1，俞书义1，郝 琴2

目的 了解我国海南省关节炎或神经性疾病患者的莱姆病感染状况，并确认海南省是否存在莱姆病人。方法 海南省三亚市人民医院提供血清542份，均为关节炎或神经性疾病患者。采用间接免疫荧光法(Indirect Fluorescent-Antibody Test, IFA)和免疫印迹法(Western Blot，WB)对血清标本进行莱姆病抗体检测；并采用巢式PCR法对WB抗体阳性的血清标本进行病原学检测。结果 IFA方法检测血清样本542份，54份阳性，阳性率为9.96%。应用WB法对上述54份IFA阳性血清样本进行检测，12份阳性。采用巢式PCR方法检测12份WB阳性样本，2份阳性，测序结果表明两份均为B.garinii基因型。结论 本研究证实了海南省人群中存在莱姆病。建议当地医生在诊治关节炎和神经性疾病患者时，可以考虑其是否罹患莱姆病。

莱姆病；血清标本；抗体检测；病原学检测

莱姆病是一种由蜱传播的人兽共患病，其致病病原体为伯氏疏螺旋体(Borreliaburgdorferi)，俗称莱姆病螺旋体，可引起人体多系统、多器官的损害。自1982年Burgdorfer及其同事分离到莱姆病病原体以来[1]，现已发现全世界五大洲70多个国家有莱姆病的存在，且发病区域和发病率均呈扩大和上升趋势[2]。

我国自上世纪80年代开始研究莱姆病以来，已在29个省(自治区、直辖市)开展了莱姆病人群血清流行病学调查，并从20个省(自治区、直辖市)的病人、动物和/或蜱中分离出病原体，证实我国存在莱姆病的自然疫源地，部分地区还有典型莱姆病病例存在[3-4]。莱姆病作为地方性传染病，在我国的分布也呈现区域性聚集的态势，主要集中在东北、内蒙古和新疆等地。莱姆病的发生依赖于其媒介以及宿主动物的分布[4-5]。我国南方一些地区也有莱姆病的发生，然而较之北方地区，了解相对较少。海南省位于我国南海，与中国大陆隔海相望，尚未有关于莱姆病的研究报道。因此，我们开展对海南省人群莱姆病的调查是有必要的。

根据美国CDC的建议，我们采用两步法对病人血清进行莱姆病抗体检测，即：IFA或ELISA作为初筛试验，WB作为确诊试验。根据不同的基因型，美国和欧洲分别制定了其WB检测阳性判断标准。我国也针对B.g.和B.a.两种优势基因型，制定了WB的阳性判断标准[6-7]。

1 材料方法

1.1 血清样本的收集 2013年3月6日至8月21日，我们从三亚人民医院收集了542份血清。所有血清均来源于患有关节炎症状或神经症状，均排除风湿性关节炎等其他疾病。病人的年龄跨度从3～89岁，男性比例占到病人总数的50.18%。

1.2 主要试剂 羊抗人IgM和IgG 荧光抗体、HRP标记的羊抗人IgM和SPA，均购自美国Sigma公司。DNA 提取试剂盒(DNeasy®Blood & Tissue Kit)由德国QIAGEN 公司提供。引物由天一辉远生物公司合成。PCR相关试剂由天根生物公司提供。莱姆病抗原片和WB膜条由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所莱姆病室提供。

1.3 DNA的提取

1.3.1 阳性对照DNA的提取 将我实验室保存的PD91菌株于BSK培养基中传代培养，当菌体浓度达到107bacteria/mL时，将全部培养基装至1.5 mL Eppendorf离心管中，13 200 r/min离心30 min，弃去上清液，然后用0.01 mol/L pH7.4 PBS洗涤3遍，弃去上清液，然后加入100 μL ddH2O重悬，恒温金属浴上100 ℃水煮10 min，最后3 500 r/min离心5 min，吸取上清液保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.3.2 血清样本DNA的提取 采用DNeasy®Blood & Tissue Kit(DNA 提取试剂盒)，提取542份血清样本DNA。具体操作按说明书进行。

1.4 莱姆病抗体检测

1.4.1 间接免疫荧光实验(IFA) 将血清用3%卵黄液从1∶16开始倍比稀释，在荧光显微镜40×10视野下，50%以上螺旋体染上明亮荧光，抗体效价IgM≥1∶64，IgG≥1∶128为阳性。同时做阳性、阴性对照。

1.4.2 蛋白免疫印迹法 (WB) 将IFA初筛的阳性标本，进一步用WB检测。用PBS-T以1∶25稀释血清并浸泡抗原条，震荡4 h，洗脱5次，每次至少10 min，将抗原条分别加入二抗IgG或IgM，过夜。再经过洗脱5次，每次至少10 min，加入显色剂显色30 min。显色结束，用纯水终止反应。WB结果根据中国莱姆病WB诊断标准进行判定[6-7]。

1.5 Nested PCR

1.5.1 引物 引物参照文献[8]的rrf(5S)-rrl(23S) rRNA基因间隔区巢式PCR的引物，引物序列见表1。

1.5.2 巢式PCR反应体系及条件 50 μL反应体系：2×Taq MasterMix 25 μL，上下游引物(100 μmol/L)各1 μL，第一轮模板4 μL，第二轮模板0.5 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s(第二轮退火温度为55 ℃)，72 ℃延伸45 s，35个循环后72 ℃延伸5 min。

1.5.3 巢式PCR产物检测 巢式PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪成像拍照。阳性片段约为250 bp左右。

1.5.4 测序及序列分析 将巢式PCR产物送北京擎科生物工程有限公司测序，并在美国NCBI网站上用BLAST对序列进行比对分析。

2 结 果

2.1 莱姆病血清学抗体检测结果 利用IFA方法检测血清样本542份, 54份阳性，其中IgG阳性40份，IgM阳性共16份，有2份样本的IgG和IgM同时为阳性(见表2)。这次调查结果显示，海南省关节炎或神经性疾病患者的莱姆病的IFA阳性率为9.96%。54例阳性标本的患者年龄跨度为15～93岁。其中10～39岁有13人，40～69岁有20人，70～99岁有11人，另有10份样本无年龄报告。全部54份阳性包括25名男性患者，29名女性患者。

对IFA检测阳性的54份血清样本进一步用WB方法确认，结果显示共有12份WB检测阳性，其中IgG阳性7份，IgM阳性5份。具体结果见表3。

2.2 Nested PCR检测结果 我们利用巢式PCR方法对12份WB检测阳性的标本进行基因扩增，结果显示有2例病人血清呈阳性。测序结果与美国NCBI网站上的参考序列比对发现两例阳性病人标本所扩增出的基因片段均与B.garinii.基因型高度相似。2例病人中1例为83岁女性神经系统疾病患者(No.750)，其WB IgM阳性,为近期感染的患者；另1例为56岁男性关节炎患者(No.392)，其WB IgG阳性,为感染4～6周以上的患者。

3 讨 论

莱姆病分布广泛，全球已有70多个国家报告发现该病，且发病率呈上升趋势，新的疫源地不断发现。莱姆病的传播主要依赖于媒介蜱及其宿主动物。这种自然疫源性疾病根据不同的地理环境，在自然界的循环也不同[9]。国内许多研究表明，我国29个省(市、自治区)在不同程度上都有人感染莱姆病的报道，感染率较高的地区主要集中在东北林区、内蒙古地区、新疆中部以及甘肃等地。南方一些地区比如云贵高原、湖北、福建等地也有莱姆病病例的报道[3-4,10-11]。海南省位于我国南海，它的自然地理条件与我国莱姆病发生率高的地区差异极大，尚未有过报道。 2011年的一项调查研究证明海南省存在蜱传疾病[12]，因此对海南省进行莱姆病调查是有必要的。

本次研究首次从海南省当地人群血清中检出莱姆病的感染，表明海南省人群中存在莱姆病的感染，在关节炎和神经性疾病患者中其莱姆病感染率达9.96%，并且通过WB方法，确诊莱姆病12例。表明在海南省存在临床表现为关节炎和神经系统症状的莱姆病患者。提示当地的临床医生在遇到相关症状的病人时应考虑莱姆病的鉴别诊断。

利用rrf-rrl基因间隔区nested PCR方法，对血清学确诊的12例阳性病例进行检测，发现2例检测结果呈阳性。序列分析表明此2例患者为B.garinii基因型菌株感染，提示海南省存在B.garinii基因型致病性菌株. 海南省位于我国南海，其地理气候与台湾岛以及广东、福建等沿海省份相近。台湾为莱姆病的自然疫源地，存在多种基因型的莱姆病螺旋体，其主要传播媒介为粒形硬蜱，主要宿主动物为黄毛鼠和褐家鼠[13-14]。广东和福建也早在90年代就被证实存在莱姆病的自然疫源地，福建从粒形硬蜱和社鼠、褐家鼠体内分离到莱姆病螺旋体[11]，广东省从白腹巨鼠和针毛鼠分离到莱姆病螺旋体[15-16]。

今后应进一步对海南省的媒介、宿主等进行调查，从而明确海南省莱姆病的主要媒介和宿主动物，以及主要病原类型，从而为海南省莱姆病的防控提供科学依据。

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Investigation on Lyme Disease of patients with arthritis or neurological disorders in Hainan Province, China

ZHU Xiong1,ZHANG Lin2,HOU Xue-xia2,GENG Zhen2,CHEN Hai1,CHEN Ting1,YU Shu-yi1,HAO Qin2

(1.Clinical Laboratory, Sanya Peoples' Hospital, Hainan Province, Sanya 572000, China; 2.State Key Laboratory for Infectious Diseases Prevention and Control, National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

To investigate the infection status of Lyme spirochete in patients with arthritis or neurological disease in Hainan Province of China, and to confirm the presence of Lyme disease in Hainan Province, a total of 542 serum samples with arthritis or nervous system disease suspected withB.burgdorferiinfection were collected from Sanya Peoples' Hospital, Hainan Province. Antibodies for Lyme disease in serum samples were detected by Indirect Fluorescent-Antibody Test (IFA) and Western blot (WB); and the nested PCR method was used to test the pathogen in the WB positive serum samples. Results showed that 54 in total of 542 serum samples were tested positive by IFA, the positive rate was 9.96%. In the 54 IFA-positives, 12 were confirmed positive by WB. Two in 12 WB confirmed positives were tested positive by nested PCR. Sequence analysis showed the two samples were infected byB.gariniistrains. This research confirmed the existence of human Lyme disease in Hainan Province. We suggested that Lyme disease should be commonly considered by clinicians when the patients had some related symptoms of Lyme disease in Hainan, China.

Lyme disease; serum samples; antibody test; etiological test

Hao Qin, Email: haoqin@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.013

国家“十二五”传染病重大专项(2012ZX10004219 和2013ZX10004-101)；海南省自然科学基金项目(814389)；三亚市医疗卫生科技创新项目(YW1244)(朱雄和张琳同等贡献)

郝琴，Email: haoqin@icdc.cn

1.海南省三亚市人民医院检验科，三亚 572000; 2.中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，传染病预防控制国家重点实验室,北京 102206

R514

A

1002-2694(2015)04-0353-04

2014-11-02；

2015-01-05

Supported by the Major Project of the Twelfth Five Year Special for infectious diseases (Nos. 2012ZX10004219 and 2013ZX10004-101), the Natural Science Foundation of Hainan Province (No. 814389), and the Innovation Projects of Science and Technology in Medical and Health Area, Sanya (No. YW1244)

Zhu Xiong and Zhang Lin contribute equally to this study.