CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

许 艳，陈海丽，刘晓茜，熊延青，席秀红，宰淑蓓，蔡金凤，卢水华，朱召芹

CFP10-ESAT6融合蛋白用于结核分枝杆菌感染诊断ELISA方法的初步研究

许 艳，陈海丽，刘晓茜，熊延青，席秀红，宰淑蓓，蔡金凤，卢水华，朱召芹

目的 制备结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白，探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分枝杆菌免疫诊断中的应用价值。方法 PCR扩增得到CFP-10、ESAT6基因片断，将其先后克隆入pET-28a表达载体。优化表达条件、用镍亲和层析的方法纯化带His标签的重组CFP10-ESAT6融合蛋白(rCFP10-ESAT6)。制备兔多克隆抗体，建立rCFP10-ESAT6为抗原的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法，以健康者血清为对照，检测170例结核患者血清的抗体。结果 重组质粒 pET28a-CFP10-ESAT6靶基因测序结果与预计设计完全一致。融合蛋白在E.coliBL21(DE3)工程菌中均为可溶性表达，表达量占菌体总蛋白的40%。利用金属螯合亲和层析直接纯化重组蛋白，纯度达到95%以上。Western blot分析表明，重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应，与健康者血清不发生反应。CFP10-ESAT6的兔多克隆抗体的效价为1∶8 000，CFP10-ESAT6作为包被抗原的检测结核病人血清中特异性抗体的间接ELISA最佳包被浓度为0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀释度为1∶500。检测结果与临床诊断的符合率，ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>ELISA(kit)。结论 CFP10-ESAT6融合蛋白具有较高的抗原特异性和免疫反应性，有可能成为结核病免疫学诊断的特异抗原，对结核的诊断具有重要参考价值。

结核分枝杆菌；CFP10-ESAT6；酶联免疫吸附试验(ELISA)

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一种慢性传染病，是危害人类健康的重要传染病之一。控制结核病的流行与蔓延的关键在于找到简便、快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法[1-3]。虽然细菌学检查仍是结核病诊断的金标准，但由于涂片阳性率较低，培养又需时太久，所以发展免疫学诊断对结核病的诊断具有重要参考价值[3，8]。

目前临床上使用ELISA诊断方法的特异性较差，主要原因是现行的ELISA方法无法区分致病性结核杆菌感染和BCG接种者[4-5]。卡介苗及其它非致病性分枝杆菌中不存在RD1区，因此RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。CFP10和ESAT6的编码基因均位于RD1区，是重要的T细胞抗原，具有良好的免疫原性，能诱导机体产生特异性免疫应答，且具有强烈的免疫原性，成为研究结核病诊断与预防的热点[6，9-10]。因此可将CFP10和ESAT6作为诊断结核杆菌感染的特异性试剂[7，11]。

由于单一蛋白在诊断上灵敏度较差，因此我们通过基因工程的方法在大肠杆菌中表达了重组融合蛋白CFP10-ESAT6，建立检测人血清中抗结核杆菌抗体的间接ELISA方法，并探讨CFP10-ESAT6融合蛋白在结核分支杆菌免疫诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株、质粒与菌株 结核分支杆菌H37Rv、大肠工程菌TOP10、BL21(DE3)由本实验室是保存，pET28a(+)表达质粒购自Novagen(USA)。

1.1.2 主要试剂 限制性核酸内切酶NdeI、BamH I、SacI和HindⅢ、PCR相关试剂及DNA marker购自TaKaRa公司；T4 DNA连接酶购自Promega公司；DNA回收试剂盒购自Qiagen公司；IPTG购自捷瑞生物公司；抗His-tag单克隆抗体及蛋白质纯化试剂盒购自Novagen公司；除盐柱购自Millipore公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠二抗购自Sigma公司；羊抗人二抗购自Proteintech group公司；其它试剂均为国产分析纯试剂。

1.1.3 结核免疫诊断试剂 奥普结核分枝杆菌抗体胶体金法诊断试剂盒购自上海奥普生物技术有限公司，操作按诊断试剂说明书进行。

1.1.4 实验动物 雌性新西兰大白兔1只，质量3 kg左右,来自上海市公共卫生临床中心动物中心。

1.1.5 血清 血清取至上海市公共卫生临床中心住院患者，TB并排除HIV感染病人血清170例。查阅病例病史，入选TB病例均符合中华人民共和国卫生部颁布的《中华人民共和国传染病防治法》所规定结核病病例诊断标准，主要为痰涂片结果、痰培养结果、影像学结果、入院诊断、初步诊断及出院诊断等相关病史，并参照前期ELISPOT检测结果进行分组[14]。在研究的170位病例中，明确诊断阳性：即痰涂片或痰培养阳性55人，痰涂片或痰培养均阴性，但胸x线片有肺结核特征病灶的有53人，故传染性肺结核诊断明确的有108人；痰涂片和痰培养阴性，但具备菌阴性肺结核诊断标准1～6中3项或7～8条中任何1项的有22人；排除结核病的有40人。同时，选取妇产科排除TB病例60例作为对照组。

1.2 方法

1.2.1 扩增目的基因 实验用到的引物见表1。引物由上海生工生物工程公司合成，扩增条件为：94℃ 预变性5 min， 94 ℃,30 s；55 ℃,30 s；72 ℃, 45 s，共30个循环。

1.2.2 重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6的构建 用Qiagen PCR产物纯化试剂盒纯化CFP10和ESAT6表达片段PCR产物，分别连入pMD18-T 载体，将连接产物转化TOP10感受态细胞，提取质粒、酶切和测序鉴定。用NdeI和HamH I双酶切pET28a(+)和pMD18-T-CFP10重组质粒，连接后转化TOP10感受态细胞，提取质粒、酶切和测序鉴定。SacI和HindⅢ双酶切pMD18-T-ESAT6和pET28a-CFP10，回收ESAT6片断与线性化的载体pET28a-CFP10,连接后转化TOP10感受态细胞，提取质粒后进行酶切鉴定。

1.2.3 重组融合蛋白诱导表达和鉴定 将鉴定正确的重组质粒pET28a-CFP10-ESAT6转入大肠杆菌BL21(DE3)中，挑取单克隆接种于5 mL含卡那霉素的LB中37 ℃振荡培养至OD600=0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导4 h后离心收集菌体。洗涤后重悬菌体沉淀，用超声破碎细菌，离心后分别取少量上清与沉淀SDS-PAGE检测。并用Western-Blotting的方法进行蛋白鉴定。

1.2.4 重组蛋白纯化和多抗制备 用Novagen 的试剂盒纯化蛋白，纯化方法及过程见操作手册，并经除盐柱除盐。以Novagen蛋白纯化试剂盒中的Binding Buffer做对照，用nanodrop1000仪器测定纯化蛋白浓度，然后用Binding Buffer稀释成使用浓度为1mg/mL。将不完全弗氏佐剂和融合蛋白CFP10-ESAT6(1 mg/mL)各0.5 mL混合,分别于第0周、2周、4周、6周采用背部皮下多点注射的免疫方式，6周后从耳静脉采血，间接ELISA测效价为1∶16 000时心脏采血，分离血清备用。

1.2.5 间接ELISA检测方法检测 以不同浓度的重组蛋白CFP10-ESAT6作为包被抗原，并且用免疫家兔获得的抗CFP10-ESAT6的多克隆抗体血清作为阳性血清，正常人血清作为阴性血清，倍比稀释后进行方阵滴定。寻找最佳的抗原包被浓度、患者血清的最佳稀释、最佳封闭条件，根据结果确定ELISA最佳反应条件。倍比稀释重组蛋白CFP10-ESAT6加入ELISA检测板中，每孔100 μL，37 ℃包被2 h；弃去孔内的液体，用1×PBST洗涤液洗涤5次，每次5次；每孔加200 μL含5%脱脂乳的PBS，37 ℃封闭2 h；拍干，每孔加入倍比稀释100 μL患者血清，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入HRP标记的羊抗人第二抗体(1∶2 500稀释)，每孔100 μL，37 ℃孵育1 h；洗涤后加入新鲜配制的底物液，每孔加100 μL，避光反应15 min，加入2 mol/L H2SO4终止反应，在酶联免疫检测仪上读取OD490值。

1.2.6 统计分析 对比融合蛋白ELISA试剂盒检测的灵敏度和特异度，且应用Stata7.0统计软件，分别采用配对卡方检验和普通卡方检验对各组检出阳性率进行统计学分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 目的基因扩增和诱导表达鉴定 CFP10与ESAT6扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定，与预期一致，见图1。融合蛋白经IPTG诱导后的菌体进行12% SDS-PAGE鉴定，结果显示，在相对分子质量24 kD处可见一明显蛋白表达条带(图2)。用抗His抗体Western blot检测目的蛋白，无非特异性条带出现(图2)。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR amplified product of target genes

2.2 融合蛋白纯化 将诱导后的表达菌，集菌后冰上超声裂解，将全菌、超声后的菌液上清、超声后的菌体沉淀进行SDS-PAGE检测。目的蛋白存在于上清中，说明重组蛋白CFP10-ESAT6为可溶性表达。将超声后的裂菌上清用试剂盒按照试剂盒说明书经Ni2+亲和层析对蛋白进行纯化，并收集过程中的缓冲液，分别SDS-PAGE，确定纯化效率(图4)。

M: Protein maker; 1: BL-21; 2: pET28a; 3: CFP10-ESAT6.

图3 目的蛋白Western-Blot验证

Fig.3 Western-Blot verification for targeted protein

M: Protein maker; 1: Whole-cell protein; 2: Supernatant after ultrasound; 3: Ultrasound after precipitation; 4: Flowthrough liquid; 5: Binding buffer; 6: Washing liquid; 7: Eluate was purified protein.

图4 融合蛋白纯化

Fig.4 Fusion protein purification

2.3 融合蛋白纯化后除盐浓缩 用Millpore的除盐柱除盐后作12%SDS-PAGE可见纯度较高的蛋白条带。

M: Protein maker; 1-3: Desalted protein.

图5 纯化后用millpore的除盐柱除盐

Fig.5 Purified CFP10-ESAT6 was desalinated using a millpore desalting column

2.4 间接ELISA检测方法的应用 选取170例确诊结核患者和60份健康患者的血清[15]，利用棋盘法，将不同稀释度蛋白浓度包被后(包被液为5%脱脂乳)，加入不同稀释度确诊患者和健康血清，根据检测ELSIA孔结果的读取值比较，确定融合蛋白CFP10-ESAT6的最佳包被浓度为0.002 μg/mL，患者血清的最佳稀释度为1∶500稀释。

2.5 CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA检测方法比较

2.5.1 总体阳性率比较 在130位病例中，用CFP10-ESAT6融合蛋白ELISA检测方法检测，阳性87例，阴性27例，无法判断16例；用商品化的胶体金试剂盒检测，阳性79例，阴性51例，其阳性检出率分别为66.92%和55.39%。而ELISPOT检测阳性109例，阴性17例，无法判断4例，总体阳性检出率为83.84%(见表2)。

表2 ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和胶体金检测结果

Tab.2 Outcome of ELISPOT, ELISA (rCFP10-ESAT6) and Colloidal gold

2.5.2 ELISPOT和ELISA诊断结果与明确诊断的符合程度对比 ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和胶体金方法分别与临床明确诊断的符合率分别为85.22%(n=196，196/230)、71.30%(n=164，164/230)和62.61%(n=144，144/230)，检测结果与临床明确诊断的符合率为，ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>胶体金。ELISPOT的灵敏度和特异度分别为86.51%和95.60%，ELISA(rCFP10-ESAT6)的灵敏度和特异度分别为76.32%和90.58%，胶体金的灵敏度和特异度分别为55.38%和86.74%。

3 讨 论

结核分枝杆菌区别于卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)的重要特征是致病性结核分枝杆菌存在RD1区，而卡介苗及其它非致病性分枝杆菌中不存在。RD1区基因所编码的蛋白在结核分枝杆菌疫苗研制开发和检验诊断方面都受到了广泛的关注。大量研究表明CFP-10和ESAT-6这两种小分子蛋白具有很强的细胞免疫活性,在感染早期,T细胞识别这两个抗原,介导机体产生保护性细胞免疫应答，成为研究结核病诊断与预防的热点[6，9-10]。CFP10与ESAT6有丰富的抗原表位，作为结核感染的诊断抗原具有明显的优势[9-13]，CFP10与ESAT6抗原在人和牛结核分枝杆菌感染诊断中均有较高的特异性和敏感性[11-13]。

由于CFP10和EAST6是结核杆菌早期感染导致宿主产生的两种分泌性小分子蛋白，为了增加蛋白的免疫原性，本实验在大肠杆菌中成功表达了融合蛋白CFP10-ESAT6，用此蛋白免疫家兔，获得高效价抗CFP10-ESAT6多克隆抗体，建立以间接ELISA为基础的结核抗体检测方法。在170份确诊结核患者血清和60例健康血清进行检测后[14]，确定最佳抗原包被浓度为0.002 μg/mL和最佳血清稀释度为1∶500。

本研究发现，ELISPOT、ELISA(rCFP10-ESAT6)和胶体金方法分别与临床明确诊断的符合率分别为85.22%(n=196，196/230)、71.30%(n=164，164/230)和62.61%(n=144，144/230)，三种方法的检测结果与临床明确诊断的符合率为ELISPOT>ELISA(rCFP10-ESAT6)>胶体金。ELISPOT的灵敏度和特异性分别为86.51%和95.60%，ELISA(rCFP10-ESAT6)的灵敏度和特异性分别为76.32%和90.58%，胶体金的灵敏度和特异度分别为55.38%和86.74%。因此，融合蛋白rCFP10-ESAT6和灵敏度和特异性均优于商品化的胶体金试剂盒。

ELISA也存在一定比例的假阳性与假阴性，可能与下列因素有关：如结核杆菌型别不同，故可能局限部分检出率。而假阳性可能是因为有些人过去感染过结核杆菌或其它非特异性物质的干扰。为了更好的对该诊断方法进行评估，我们选取确诊结核患者血清和健康血清，对实验操作中的参数进行调整，综合判断，确定最佳检测参数。

结果表明，来源于结核杆菌RD1区的重组CFP10-ESAT6融合蛋白有望开发为结核血清学诊断用新抗原。

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Usage of CFP10-ESAT6 fusing protein as a ELISA diagnostic method for TB

XU Yan,CHEN Hai-li,LIU Xiao-qian,XIONG Yan-qing,XI Xiu-hong,ZAI Shu-bei,CAI Jin-feng,LU Shui-hua,ZHU Zhao-qin

(Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China)

In this study, we prepared theMycobacteriumtuberculosisCFP10-ESAT6 fusion protein and evaluate its potential value for immunodiagnosis of tuberculosis. Thecfp-10 andesat6 gene fragments were amplified respectively and cloned into the pET-28a expression vector. Optimized the expression conditions, His-tagged recombinant CFP10-ESAT6 protein (rCFP10-ESAT6) was purified using nickel affinity chromatography. Rabbit polyclonal antibody was prepared to establish rCFP10-ESAT6 antigen enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method. We detected 170 tuberculosis sera antibodies and 60 health sera as negative control. Results showed that the recombinant plasmid pET28a-CFP10-ESAT6 target gene sequencing results consisted with the expected design. Soluble expression CFP10-ESAT6 was accounted for 40% of the total bacterial protein inE.coliBL21 (DE3). We used metal chelate affinity chromatography to purify the recombinant proteins directly, which was over 90% purity. Western blot analysis showed the recombinant protein in TB patient sera with specific immune response. CFP10-ESAT6 rabbit polyclonal antibody was in a titer of 1∶8 000. The optimal coating concentration of CFP10-ESAT6 as coating antigen-specific antibodies in serum indirect ELISA was 0.002 μg/mL and the optimal serum dilution was 1∶500. Results' consistency with clinical diagnosis of three methods was ELISPOT>ELISA (rCFP10-ESAT6)>colloidal gold. We established an indirect ELISA method that CFP10-ESAT6 as a coating antigen for TB antibodies in human serum. CFP10-ESAT6 fusion protein was efficiently expressed in pET28a-CFP10-ESAT6/BL21 (DE3), which may be a potential immunological diagnosis of tuberculosis-specific antigens.

Zhu Zhao-qin; Email:zhaoqinzhu@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.005

上海市卫生局面上基金(No.20124467)，国家自然科学基金青年基金(No.31200108)，十二五科技重大专项(No.2013ZX10004-221和2013ZX10004221-004)

朱召芹，Email：zhaoqinzhu@163.com

上海市公共卫生临床中心,上海 201508

R378.91

A

1002-2694(2015)04-0315-05

2014-05-30；

2015-01-12