湖北2013年部分柯萨奇A16型肠道病毒VP1基因分子特征分析

李 静,占建波，杨朝晖,雷亚克,张 婷,李国明

湖北2013年部分柯萨奇A16型肠道病毒VP1基因分子特征分析

李 静,占建波，杨朝晖,雷亚克,张 婷,李国明

目的 全面研究和了解2013年湖北省柯萨奇A16型的VP1基因特征，分析CVA16型病毒在我省的基因型别及分子进化分析。方法 对2013年湖北省21株CVA16病毒流行株进行VP1区全长基因序列测定，并对核苷酸及氨基酸序列进行同源性比较及系统进化分析。结果 2013年湖北省21株CVA16型病毒流行株的VP1区核苷酸序列全长均为891 bp，VP1区核苷酸和蛋白氨基酸序列同源性分别为90.0% ～ 100.0 % 和96.3% ～100.0%。VP1区基因系统进化分析表明，湖北CVA16流行株主要位于ligeage1和3分支上，分属于B1a和B1b基因亚型。结论 2013年湖北省21株CVA16型流行株主要为B1b基因亚型，其次为B1a基因亚型，在同一地区有两种基因亚型的 CVA 16 病毒同时存在, 在不同的地区存在同一种亚型的CVA16病毒。

柯萨奇病毒CVA16型；VP1区；基因特征

手足口病(Hand-Foot-Mouth disease，HFMD)是由肠道病毒引起的传染病，多发生于5岁以下儿童。引发手足口病的肠道病毒有20多种(型)，以柯萨奇病毒A16型(CVA16)和肠道病毒71型(EV 71)最为常见[1]。虽然CVA16与EV71型病毒在遗传上有一定的相似性，但CVA16具有自己的遗传特性和分子生物学特征。CVA16引起的手足口病症状较轻，较少有并发症发生，但CVA16和 EV 71的共同流行常会导致比较严重的手足口病疫情[2]。

本研究根据2013年湖北省部分地区HFMD病原学监测结果，对CA16型病毒进行VP1基因序列测定和进化分析，了解CA16型病毒在湖北省的主要型别以及分子流行病学特点。

1 材料和方法

1.1 标本来源 采自湖北省2013年手足口病监测哨点医院手足口病患儿的咽拭子、肛拭子、疱疹液标本。

1.2 病毒核酸提取 对手足口病标本病毒核酸直接进行提取，核酸提取采用Qiagen公司的Viral RNA Mini Extraction Kit提取，具体步骤见产品说明书。提取的RNA溶于50 μL RNase-free ddH2O中，于-70 ℃冻存备用。

1.3 CVA16病毒核酸阳性的鉴定 对送检标本的核酸进行real-time RT-PCR检测，对CVA16病毒核酸检测阳性标本进一步进行VP1基因扩增。Real-time RT-PCR试剂盒购自江苏硕世生物科技有限公司。

1.4 CVA16病毒VP1基因引物设计 对CVA16病毒核酸real-time RT-PCR检测阳性的标本直接进行VP1基因扩增，VP1基因上下游扩增引物[3]分别为CVA16-VP1-S: 5′-ATTGGTGCTCCCACTACAGC-3′ (nucleotides 2335 to 2354); CVA16-VP1-A: 5′-GCTGTCCTCCCACACAAGAT-3′ (nucleotides 3426 to 3445)。预期扩增片段长度约为1 100 bp。

1.5 CVA16病毒VP1基因RT-PCR扩增和测序 采用one-step RT-PCR方法进行VP1基因进行扩增。one-step RT-PCR Kit、Taq DNA聚合酶，dNTPs等均购自Takara公司。VP1基因扩增反应条件为：94 ℃预变性3 min，94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35个循环, 最后72 ℃，7 min。PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳后，采用凝胶图像分析系统进行分析。所得PCR产物直接进行序列测定(由上海生工完成)。

1.6 CVA16病毒VP1基因同源性和进化分析 将所测到的CVA16病毒的VP1序列与GenBank中其他CVA16病毒的VP1序列进行同源性比较和进化分析。序列分析和进化树分析采用DNAStar MegAlign软件和Mega5.0软件。

2 结 果

2.1 VP1基因核苷酸同源性分析 对湖北省21株CVA16型流行株进行VP1基因核苷酸序列测定和分析。CVA16毒株VP1基因核苷酸序列长度为891 bp，编码297个氨基酸。利用DNAStar MegAlign软件进行VP1基因核苷酸和氨基酸序列比对分析。21株CVA16毒株的核苷酸与氨基酸序列同源性分别为90.0%～100.0%、96.3%～100.0%。21株毒株的VP1基因与A基因型代表株CVA16 G-10株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为75.3%～76.9%、88.9-92.6%, 与B基因型各亚型B1a、B1b、B1c和 B2株VP1区核苷酸同源性比较结果见表1。

表1 湖北CVA16流行株与CVA16病毒不同基因型及亚型代表株VP1核苷酸与氨基酸同源性比较

Tab.1 Homology comparison of nucleotide sequence and amino acid sequence among CVA16 strains from Hubei and other different genotype (subgenotype) CVA16 strains on VP1 genes

▲CVA16 strains from Wuhan; △CVA16 strains from Shiyan; ■CVA16 strains from Huangshi; □CVA16 strains from Jingzhou; ○CVA16 strains from Xiantao; ●CVA16 strains from Xianning;◇CVA16 strains from Ezhou.

图1 湖北CVA16流行株V P1全基因序列进化分析

Fig.1 Phylogenetic analysis based on the alignment of the complete VP1 gene sequences of CVA16

2.2 CVA16毒株VP1基因分子进化分析 利用Mega5.0 软件， 运用maximun-likelihood方法，根据CVA16病毒全长VP1基因核苷酸序列进行分子进化分析。湖北CVA 16 流行株分别与lineage1和lineage3代表株处于一簇(见图1)，且与B1a 和 B1b 亚型代表株分别处于同一分支上(见图2)。21株CVA16毒株分别来自于武汉(WH)、鄂州(EZ)、咸宁(XN)、十堰(SY)、荆州(JZ)、黄石(HS)和仙桃(XT)。从进化树上可以发现，武汉、荆州和鄂州地区的CVA16毒株存在不同的基因谱系的CVA16毒株，以及不同基因亚型的CVA16毒株。

Fig.2 Phylogenetic and subgenotype analysis based on the VP1 gene sequences of CVA16 in Hubei Province, China

2.3 湖北CVA 16流行株的 V P1 区编码蛋白变异位点分析 对21株湖北CVA16 流行株VP1区核苷酸序列推导出的氨基酸序列与CVA16 病毒 A、B1a、B1 b、B1c 和 B2基因型及亚型代表株VP1区的氨基酸序列进行比对分析，变异位点结果见表2。21株CVA16流行株与原型株 G 10之间的氨基酸变异位点进行比较，其中JZ144-HB-2013株变异位点较多。在第 23位氨基酸位点处，9株CVA16流行株发生L→M的突变，与B1a亚型代表株马来西亚MY823-3-SAR-97株(AM292443)一致。

3 讨 论

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD) 是由肠道病毒引起的传染病，引发HFMD的肠道病毒有20多种(型)，柯萨奇病毒A组的16、4、5、9、10型，B组的2、5型，以及肠道病毒71型(Enterovirus71，EV71)均为HFMD 较常见的病原体， 其中以柯萨奇病毒CVA16型和EV71最为常见[4]。CVA16病毒为单股正链RNA病毒，小RNA病毒科，肠道病毒属成员。病毒为二十面体立体对称球形结构，病毒衣壳由VP1、VP2、VP3和VP4 4种多肽组成，其中VP1、VP2和VP3位于衣壳表面，VP4位于病毒衣壳内部。VP1区长891bp，编码297个氨基酸残基，是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位，也是肠道病毒血清型的分型依据[5-6]。因此CVA16病毒VP1区核苷酸和氨基酸变异及分子进化分析，有助于了解湖北省CVA16型病毒的分子流行病学特征。

本研究对湖北省21株CVA16型流行株进行VP1基因核苷酸序列测定和分析，该21株CVA16毒株的VP1基因核苷酸与氨基酸序列同源性分别为90.0%～100.0%、96.3%～100.0%。与A基因型代表株CVA16 G-10株VP1区核苷酸和氨基酸同源性分别为75.3%～76.9%、88.9%～92.6%,与B基因型各亚型B1a、B1b、B1c和B2株VP1区核苷酸同源性分别为91.4%～95.8%，91.2%～97.0%，90.7%～92.9%，87.9%～91.1%；氨基酸同源性分别为96.0%～100.0%，95.6%～100.0%，95.3%～99.0%，96.3%～100.0%。根据核苷酸和氨基酸序列同源性分析结果，可以看到CVA16病毒VP1区核苷酸变异虽大，但氨基酸同源性较高，推测存在一定的同义突变。对CVA16病毒VP1区氨基酸序列变异位点分析发现，仅JZ144-HB-2013株变异位点较多。在第23位氨基酸位点处，有9株CVA16流行株发生L→M的突变，与B1a亚型代表株马来西亚MY823-3-SAR-97株(AM292443)一致。

目前CVA16病毒基因分型主要有两种方法，分别基于衣壳蛋白VP4区和VP1区核苷酸序列。Li等[7]根据CVA16病毒VP4核苷酸序列将CVA16分为A、B、C 三个分支。 Zhou等[8]根据VP1核苷酸序列对CVA16 病毒进行分型分析，将CVA16分为A和B两个基因型，其中B基因型有进一步分为B1 (B1a和B1b)， B2以及B3基因亚型。主要为B1亚型，B1亚型又可以分为B1a和B1b两个型别，B1a亚型主要为1999-2008年中国CVA16毒株，而B1b主要为2005-2006年的中国CVA16毒株，B2基因亚型主要为1999-2000年的中国CVA16毒株。根据进化分析的Bootstrap值(99%)以及与B1和B2亚型核苷酸序列的9.0%～13.4%差异，划分出B3基因亚型。Perera[9]等分析CVA16原型株G-10与其它所有CVA16毒株的VP1全基因核苷酸序列的差异为27.7%～30.2%，将G-10株划分为A基因型。而其它所有CVA16 毒株VP1核苷酸差异均低于13.4%，因此将其它所有CVA16毒株划分为B基因亚型。 其中B基因亚型的CVA16毒株根据Bootstrap值(>99%)进一步分为两个基因谱系lineages 1和2。根据CVA16病毒的基因型别之间VP1全基因序列的核苷酸差异至少为15%[9]，Zhang[3]等根据VP1核苷酸序列将中国CVA16毒株分为A和B两个基因型，将B 基因型划分为3个基因谱系lineage1、2和3，并根据核苷酸差异和进化分析进一步将B基因型分为B1和B2两个基因亚型，B1亚型又分为B1a、B1b和B1c三个型别，其中B1a和B1b之间的核苷酸差异为6.5% ，B1c和B1a、B1c和B1b 之间的核苷酸差异分别为7.0% 和6.8%。Iwai[10]等将CVA16A、B和C三个型别，其中B和C分别相当于Zhang等学者划分的 B2和B1亚型。Zhang等研究表明，中国1999-2008年的CVA16毒株主要为B1a和B1b基因亚型，同一时期在台湾、马来西亚、泰国、澳大利亚、越南以及沙特阿拉伯的CVA16毒株也分属于B1a和B1b两个基因亚型。这说明中国的CVA16毒株与上述地区及国家流行CVA16毒株是共同进化或流行。仅马来西亚SB16087/MAL/2005)株单独位于一个分支，形成B1c基因亚型。

Note:□The differences in amino acid sites

本研究根据Zhang等学者的分类方法，将湖北省21株CVA16毒株进行进化分析，发现湖北省CVA16毒株为B基因型，分别属于lineage 1和3两个基因谱系，基因型别分析分别为B1a和B1b基因亚型。在同一地区有两种基因亚型的 CVA 16 病毒同时存在, 在不同的地区存在同一种亚型的CVA16病毒, 说明湖北省CVA 16病毒的B1a与B1 b两种基因亚型共同进化与流行，主要流行的CVA 16 病毒为 B1b 基因亚型。

本研究对湖北省手足口病的 CVA 16流行株VP1基因进行核苷酸变异和分子进化分析, 了解湖北省CVA 16病毒的基因特征和流行情况, 为手足口病的防控提供了基础资料。

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VP1 gene of Coxsackie virus A16 from Hubei Province, China, 2013

LI Jing,ZHAN Jian-bo,YANG Zhao-hui,LEI Ya-ke,ZHANG Ting,LI Guo-ming

(Hubei Center for Disease Control and Prevention, Wuhan 430079, China)

In order to investigate the genetic background of Coxsackie virus A16 (CVA16) in Hubei Province, China, the genetic characteristics of VP1 genes of CVA16 strains were analyzed in this study. The complete VP1 sequences of 21 CVA16 strains from clinical samples were amplified by one-step RT-PCR and sequenced to engage the homological and phylogenetic analysis. The full-length VP1 region of 21 CVA16 strains was 891 bp. The nucleotide and amino acid identity among the CVA16 strains were 90.0%-100.0% and 96.3%-100.0%, respectively. Phylogenetic analysis based on complete VP1 sequence also indicated that the 21 Hubei CVA16 strains were belonged to the lineage 1 and lineage 3 and further divided into subgenotype of B1a and B1b. The genotype of Hubei CVA16 strains were mainly B1b subgenotype followed by B1a subgenotype. In the same areas, two kinds of subgenotype of CVA16 co-existed and the same subgenotype CVA16 was prevalent in different areas in Hubei Province, China.

Coxsackie virus A16; VP1 gene; molecular characteristics

Li Guo-ming, Email:liguominghb@163.com

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.006

李国明，Email：liguominghb@163.com

湖北省疾病预防控制中心，武汉 430079

R373.2

A

1002-2694(2015)04-0320-05

2014-05-18；

2015-01-07

国家科技重大专项课题(No.2012ZX10004207)

Supported by the Project of Pathogen Spectrum Research of Infectious Disease in Hubei Province (No. 2012ZX10004207-002)