环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究

曹志强，张翠彩，李秀文，蒋秀高

环介导等温扩增技术检测钩端螺旋体的研究

曹志强，张翠彩，李秀文，蒋秀高

目的 利用环介导等温扩增技术，建立检测钩端螺旋体的方法。方法 选取钩体LipL32基因，设计了LAMP引物。对27株钩体、25株非钩体样本予以检测，然后进行灵敏度和模拟样本的研究。结果 扩增27株钩体结果为阳性，扩增25株非钩体结果为阴性。灵敏度为200拷贝/μL，模拟样本检测下限为200条钩体/μL(煮沸法)和20条钩体/μL(试剂盒提取法)。结论 LAMP实验操作简单，对设备要求不高，可以作为钩体的快速检测方法。

问号钩端螺旋体属；环介导等温扩增；检测；核酸扩增

钩端螺旋体病(leptospirosis，简称钩体病)是由致病性钩端螺旋体(简称钩体)感染引起的人兽共患传染病，流行范围广，危害大[1]。患病的动物或人可通过排泄尿液的方式，将钩体菌传播到自然界，通过破损的皮肤或粘膜进入人体可导致人类的感染。在我国，钩体病多发生于水稻种植区域，也是洪涝灾害时重点监控的传染病之一。为了有效控制钩体病的发生，必须加强钩体病的流行病学监测，以便更好地控制钩体病的发生和流行。目前钩体检测的方法很多，但存在一定的缺陷，比如钩体菌分离培养受杂菌、抗生素等因素影响，培养阳性率不高，培养周期长；经典方法显微凝集试验(microscopic agglutination test, MAT)适用于血清抗体检测，需要对实验所用钩体进行接种培养[2]；普通PCR方法[3]和实时荧光定量PCR方法[4]近几年被用于钩体检测方面，具有快速和灵敏的特点，但该检测方法存在一定的操作复杂性和仪器昂贵等问题，在一些发展中国家和现场检测方面受到限制。

LAMP技术是一种比较新的核酸等温扩增技术，能在60～65 ℃常温状态下1 h左右的时间完成目的基因的扩增[5]。LMAP引物共有两对，针对目的基因6个不同区域，具有很高的特异度和灵敏度。LAMP方法反应时间短、结果判定方便、不需要昂贵的设备仪器，而且对模板的纯度要求不高，大大减少了DNA提取和纯化的时间，被广泛应用于病毒、细菌、寄生虫的检测和相关疾病的诊断。目前针对LMAP检测致病性钩体的目的基因主要有16S rRNA[6]和外膜蛋LipL41[7]。 本研究以钩体外膜蛋白LipL32靶基因为目的基因，LipL32是钩体表面重要蛋白，占75%的总蛋白含量，是引起人和动物免疫的重要蛋白[8]。以此设计引物，建立LAMP检测技术进行扩增检测，并对扩增产物进行电泳，并在此基础上应用SYBR GREEN Ⅰ判定反应结果，使LAMP的结果判定更简单、直观，为钩体传染监测和临床诊断提供快速可视化的检测方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 本研究选用的27株待测钩体菌株由中国疾病预防控制中心钩体病实验室保存，代表了我国常见的致病性血清群、型，菌株由常规的EMJH培养基培养7～10 d待用；其它25株非钩体菌株DNA由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所莱姆病室、细菌耐药室、应急实验室、呼吸道传染病室提供，包括伯氏疏螺旋体、恙虫病东方体、黑龙江斑点热立克次体、贝氏柯克斯体、大肠埃希菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、弗氏耶尔森菌、假结核耶尔森菌、沙门菌、雷氏普罗威登斯菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、单增李斯特菌、痢疾杆菌、肠侵袭性大肠埃希菌、肠产毒性大肠埃希菌、肠致病性大肠埃希菌、肠出血性大肠埃希菌。

1.1.2 试剂和仪器 环介导等温扩增DNA试剂盒(广州迪奥生物科技有限公司)、反应混合物置于Tubidimeter real-time LA-320c型LAMP实时浊度仪(日本荣研化学株式会社)、DL2000 DNA Marker和基因组DNA提纯试剂盒(康为世纪生物科技有限公司)、超纯水(北京天根生化科技有限公司)、PCR反应体系Premix(包括TaqDNA聚合酶、dNTPs mixture、buffer)为TaKaRA公司产品、PCR扩增仪(德国SensoQuest-LabCycler)、凝胶成像系统(美国UVP EC3 Imaging System)、水浴锅。

1.2 方法

1.2.1 LAMP钩体检测引物及其合成 通过NCBI网站下载我国15群15型钩体标准参考菌株的LipL32序列，用Mega 5.2对序列进行多重比对，选定该15株致病性菌株中保守的一段序列。利用PrimerExplorer version 4(http://primerexplorer.jp/e/)设计引物，包括两条外引物F3、B3和两条内引物FIP、BIP和一条加快反应速率的环引物LB，引物序列详见图1、表1。

1.2.2 反应体系及条件 LMAP体系及条件 根据相关参考文献[6-7,9]和前期预实验， 采用25 μL反应体系，即：2×反应混合液12.5 μL，Bst DNA聚合酶1 μL，模板DNA 2 μL，外引物F3和B3的量各为5 pmol/L，内引物FIP和BIP的量各为加40 pmol/L，环引物为20 pmol/L。双蒸水4.5 μL补充至25 μL。上述试剂混匀后加入15～20 μL的密封液，混匀离心。将1 μL的的1∶1 000 SYBR GREEN Ⅰ显色液滴在PCR管盖中间，盖紧管盖，防止显色液坠入反应混合液中。反应混合物置于IA-320c型LAMP实时浊度仪(日本荣研化学株式会社)，63℃反应60～80 min，然后80 ℃灭活酶活性5 min。

普通PCR体系及反应条件[3]：普通PCR采用荷兰皇家热带研究院世界卫生组织钩体病参考中心设计的一对引物G1/G2，由北京康为世纪生物科技有限公司合成。引物序列为G1:5′-TGAATCGCTGTATAAAAGT-3′；G2:5′-GGAAAACAAATGGTCGGAAG-3′ 采用25 μL反应体系：2 ×热启动Taq酶预混合的PCR反应液(天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，双蒸水7 μL，DNA模板2 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；然后94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸10 min，循环30次；最后72 ℃延伸10 min。反应结束后，采用1.5%琼脂糖凝胶，120 V电压电泳30 min，凝胶成像仪观察结果。

1.2.3 三种鉴定LAMP反应产物的方法 (1)用Tubidimeter real-time LA-320c型LAMP实时浊度仪实时监测LAMP反应情况，当纵坐标轴数值超过0.1时，判定为阳性。(2)利用电泳的方法判定结果。取5 μL扩增产物与1 μL 6×lodding buffer混合均匀，采用采用2%琼脂糖凝胶，95 V电压电泳50 min，凝胶成像仪观察是否有梯形条带产生，证实LAMP反应的发生。(3) LAMP反应完成后混匀显色液与反应液，肉眼观察颜色的不同，扩增阴性的反应液呈橘红色，扩增阳性的反应液呈黄绿色。

1.2.4 特异性检测 样品为代表我国主要常见致病性血清群、型的待测菌株共计27株，25株非钩体菌DNA。钩体菌经EMJH培养基培养5～10 d后，按照基因组DNA提取试剂盒推荐步骤进行DNA提取，最后加入50 μL TAE溶解DNA。DNA的浓度的测定采用NanoDrop微量分光光度计(美国Thermo公司)。采用本研究中已设计的引物，分别对27株待验证钩体菌株DNA和25株非钩体DNA进行LAMP扩增和PCR扩增。

1.2.5 LAMP灵敏度检测及同普通PCR方法的比较 选取标准参考菌株56601，采用基因组提取试剂盒提取DNA，取1 mL浓度为1 ng/μL的DNA，10倍去离子水倍比稀释8个样本，用来研究LAMP检测灵敏度。为了减少稀释时的加样误差，分别进行3个系列的梯度稀释，再将3个系列中相同浓度的稀释液混合，DNA浓度从高(1 ng/μL)到低(0.1 fg/μL)的8个样本，从中各取2 μL作为模板，每个样本做3个平行反应。

DNA浓度转化为细菌拷贝数的计算方法[8]：拷贝数(copies/μL)=[(ng数×10-9次方)×(6.02×1023)]÷(碱基数×660) 经查阅文献及计算，钩体全基因组DNA分子量为4 700 kb[10]，1 ng/μL浓度DNA拷贝数为2×105/μL。

1.2.6 模拟尿样本检测 模拟尿样本的的方法：用0.010 mm细胞计数器和暗室显微镜对钩体56 602菌株进行计数，取1 mL菌液(含2×108条钩体)离心(1 300 g，3 min)，弃上层清液，将沉淀溶解于1 mL的健康成人尿液中，10倍体积尿液倍比稀释8个梯度。设计两组相同的模拟尿样本，第一组采用煮沸法的方法，第二组采用基因提取试剂盒的方法。LMAP方法分别测定两组模拟样本的下限，荧光染料法判定结果。

2 结 果

2.1 LAMP特异性检测 如表2所示，本实验所设计的引物能成功扩增具有血清代表性的27株钩体，而不能扩增25株非钩体，表明该方法具有较好的特异性。

表2 检测27株钩体和25株非钩体的结果

Tab.2 Detection results of the 27Leptospiraand 25 other bacteria strains

2.2 LAMP灵敏度检测

2.2.1 LAMP反应过程的LA-320c型LAMP实时浊度仪测定 按照1.2.4所述，LAMP检测 8个10倍梯度稀释的DNA样品，用LA-320c型LAMP实时浊度仪监控反应进程。据图2，纵坐标轴为反应浊度值，横坐标轴为反应时间。根据横坐标轴的数值记录，大约在35～49 min之间，前4个梯度的DNA依次起峰，1 min左右均到达0.1，此时可以判定为LAMP反应结果阳性。随着反应体系内各组分的不断消耗，大约起峰后30 min左右，前4个反应结束，产物量达到最大。LAMP反应检测下限为200 copy/μL(1 pg/μL)。

Real-time monitoring of LAMP reaction at 63 ℃ for 70 min by Tubidimeter LA-320c

图2 LAMP检测钩体不同稀释度DNA的浊度反应曲线

Fig.2 Reaction curve of LAMP with serial dilution DNA

2.2.2 电泳判定LAMP产物 LAMP扩增8个10倍梯度稀释的DNA样品结束后，取5 μL扩增产物与1 μL 6×lodding buffer混合均匀，电泳、凝胶成像仪观察，结果如图3所示，可见泳道1—4有梯形条带产生，泳道5—8和阴性对照泳道无梯形条带的产生。证实前4个反应管有LAMP产物，后四个反应管无LAMP反应产物，LAMP反应的检测下限是200 copy/μL(1 pg/μL)，同LA-320c型LAMP实时浊度仪测定结果一致。

M: DL2000 Marker; 1-8: Lamp produncts from serial 10-fold dilution of DNA (1 ng/μL--0.1 fg/μL); NC: Negtive control.

图3 LAMP检测钩体不同稀释度DNA电泳图谱

Fig.3 Electrophoresis of LAMP product for serial dilution DNA

2.2.3 LAMP产物的可视化鉴定比较 在LAMP反应体系反应结束后混匀显色液SYBR GREEN Ⅰ与反应液，通过肉眼观察。结果如图4所示，1—4样品管呈黄绿色，反应判定为阳性，4—8样品管和阴性对照管呈橙红色，反应判定为阴性。可视化结果表明LAMP检测钩体DNA的灵敏度为200 copy/μL，与LA-320c型LAMP实时浊度仪测定结果、电泳成像结果一致，说明反应结束后添加SYBR GREEN Ⅰ后所呈现的颜色反应具有特异性。

Fig.4 Coloration of LAMP reaction products by SYBR GREEN Ⅰ

2.2.4 普通PCR方法检测钩体下限 按照1.2.4所述，普通PCR检测 8个10倍稀释梯度的DNA样品，1号反应管(模板浓度1 ng/μL)和2号反应管(模板浓度0.1 ng/μL)PCR检测阳性，检测下限为0.1 ng/μL(2×104copy/μL)，灵敏度低于LAMP两个数量级。

PC: Positive control; 1-8: PCR produncts from serial 10-fold dilution of DNA (1 ng/μL--0.1 fg/μL); NC: Negtive control.

图5 PCR检测钩体不同稀释度NDA的电泳图谱

Fig.5 Electrophoresis of PCR product for serial dilution DNA

综上所述：LAMP检测的检测下限为200 copy/μL，灵敏度比普通PCR高两个数量级；LA-320c型LAMP实时浊度仪测定反应曲线、SYBR GREEN Ⅰ可视化颜色鉴定及产物电泳图谱三者结果一致。

2.3 LAMP检测模拟尿样本 如图6所示，对于煮沸法提取DNA的模拟样本实验，前4个反应管呈黄绿色，LAMP检测阳性，后四个反应管呈橙红色，LAMP检测阴性，模拟样本检测下限是200条/μL。对于采用DNA提取试剂盒法的模拟样本实验，前5个反应管呈黄绿色，LAMP检测阳性，后3个反应管呈橙红色，LAMP检测阴性，模拟样本检测下限是20条/μL。

Fig.6 Coloration of LAMP reaction products of urine stimulants by SYBR GREEN Ⅰ

3 讨 论

LAMP技术是最近发展起来的病原微生物诊断技术，该技术利用两条内引物(FIP，BIP)和外引物(F3，B3)分别识别目标DNA序列中6个特定区域，无需模板变性，在恒温条件下(63～65 ℃)利用链置换(strand displacement)DNA聚合酶对目标DNA序列进行扩增反应；并且，目标DNA序列中6个特定区域被引物正确识别后扩增反应才会发生，因此LAMP技术具有极高特异性。环引物主要用来引导反应过程中子代DNA形成的茎环结构中链的延伸，加速扩增反应和提高反应的灵敏度。LAMP扩增产物的检测方法主要有3种：凝胶电泳检测、浊度检测和荧光显色检测。凝胶电泳检测的本质是用核酸染料对扩增得到的DNA进行染色，在紫外激发下显影，这个方法可直接表现反应体系中是否有DNA的合成。浊度检测的原理是在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子，焦磷酸根离子与体系本身就存在的镁离子结合就形成了焦磷酸镁沉淀，沉淀的产生可引起反应液浊度的变化。而浊度仪的工作原理就是实时的检测并记录这种浊度的变化，沉淀的产生与DNA合成是同步的，浊度仪记录的浊度达到0.1时，通过凝胶电泳检测也可以看到特异的“梯形条带”。SYBR GREEN Ⅰ显色剂能与双链DNA进行结合而发出荧光，与其他检测方法相比，荧光显色剂的应用更简捷、更直接。传统的血清学试验由于体内抗体出现较晚，而血培养费时又易污染，常常延误早期诊断时间，导致患者错过最佳治疗时间。普通PCR的检测需要专门的PCR仪器，并需要电泳来检测产物，耗时一般在2 h以上。LAMP是一种快速、简便、可靠、扩增效率极高的的检测方法，仅需要一台水浴锅，就可以在60 min内完成对钩体的检测。LAMP检测技术可以不用借助于凝胶电泳，直接在反应前添加显色剂就可以完成针对产物的检测。整个检测过程在封闭的反应管内完成，无需开盖检测，有效的避免了开盖检测造成的气溶胶污染。

在本研究中我们首先运用LAMP方法实现对钩体核酸的检测。LipL32为致病性钩体LipL32基因编码表达的一种外膜蛋白，不存在于非致病钩体中[10]，在这个研究中，我们针对保守性很好的LipL32基因设计LAMP引物，对钩体DNA进行检测，成功扩增出目的基因片段。通过比较普通PCR和LAMP在钩体检测的灵敏度和特异性方面的差异，为钩体病的临床诊断和环境监测提供一种更为有效、简便的方法。本实验可以检测出27株代表我国常见致病性的血清群、型的钩体菌株，而其它非钩体菌DNA检测均为阴性，特异性良好；LAMP检测的灵敏度为200 copy/μL，高于普通PCR两个数量级， 这提示LAMP方法可以较好的应用于现场钩体监测或者临床检测。而浊度检测方法中，反应添加荧光显色，检测过程中运用浊度仪针对扩增的过程予以实时浊度测量，最后对产物进行了电泳，结果表明，浊度仪的实时浊度、荧光显色变化和电泳的检测结果完全一致。最后，我们进行了人尿模拟样本实验，LAMP反应对许多PCR扩增的干扰因子具有很好的耐受能力，可针对煮沸法粗提的DNA模板进行有效的扩增，减少了复杂的模板准备时间和DNA纯化等过程。

综上所述， 我们在对LMAP检测钩体的实验过程中，可以看出LAMP技术具有广阔的应用前景，其优点如下：1) 恒温反应，整个过程在63～65 ℃的普通水浴锅内进行，不需要昂贵的仪器设备； 2) 反应快速，一般1 h可结束反应； 3) 检测灵敏度比普通PCR方法高两个数量级；4)操作简单、费用低，无需电泳，添加显色剂即可判定反应结果，能用于仪器设备简陋的基层实验室及现场快速检测。

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Leptospira interrogans DNA detection by loop-mediated isothermal amplification

CAO Zhi-qiang,ZHANG Cui-cai,LI Xiu-wen,JIANG Xiu-gao

(National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention, Beijing 102206, China)

Loop-mediated isothermal amplification has been widely used in pathogenic bacteria inspection. There is a lack of diagnostic tests for leptospirosis in technology-restricted settings or in emergency assistance activities. We developed and evaluated a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) method for the rapid detection of pathogenicLeptospiraspp. through amplification of lipL32 gene coding for the outer membrane protein LipL32. Specificity was high as we observed positive reactions of 27 pathogenic strains but negative reactions for other bacterial species. The lower limit of detection was 200 genomic equivalents/μL, and the sensitivity of LAMP was 100 times higher than that of PCR. The method enables detection of 200 leptospiral cells/μL following boiling of specimens and 20 leptospiral cells/μL of DNA extraction kit means. The lamp assay is easy to perform and inexpensive, so might be applied in the rapid and specific diagnosis ofLeptospira.

Leptospira; loop-mediated isothermal amplification; detection; PCR

Jiang Xiu-gao, Email:jiangxiugao@icdc.cn

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.04.001

蒋秀高，Email：jiangxiugao@icdc.cn

中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，北京 102206

R377

A

1002-2694(2015)04-0293-05

2014-08-28；

2014-11-12

国家科技重大专项 (No.2013ZX10004-101 & No.2012ZX10004-215)

Supported by the National Science and Technology Major Project (Nos. 2013ZX10004-101 and 2012ZX10004-215)