口蹄疫诊断技术的研究进展

康桂英

(内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028000)

口蹄疫诊断技术的研究进展

康桂英

(内蒙古民族大学动物科学技术学院,内蒙古通辽 028000)

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的急性、热性、高度接触性传染病。该病给养殖业带来巨大经济损失，被世界卫生组织列为A类传染病。由于该病传播迅速、难以防治，所以，准确而快速的诊断技术成为防治该病的必要措施。目前，口蹄疫的检测技术主要有病毒培养与鉴定、血清学检测技术和分子生物学技术等。

1 病毒培养与鉴定

首先，从患病家畜无菌采集病料，做病原体的分离培养与鉴定。将提取物在培养基上进行培养，然后，根据培养物的特性做出诊断。到目前为止，从病料中分离提取病原体是检测口蹄疫最可靠的方法。

1.1 细胞培养

口蹄疫病毒的分离培养最初采用单层初代猪肾细胞，随着培养系统的完善和细胞培养技术的创新，发现了许多新的培养口蹄疫病毒的细胞，常见的有初代小牛甲状腺细胞、小牛肾细胞、乳仓鼠细胞等。杨永钦等用BHK-21细胞来传代培养兔毒O型两个毒株，结果发现少量毒株在116代后可观察到点状细胞脱落、随着传代次数增加细胞病变严重。在对于AsiaⅠ兔化毒在BHK-21细胞传代培养在22代时就出现细胞脱落。王光祥等用仔猪心肌原代细胞对口蹄疫病毒进行培养，然后再用ELISA检测方法对所培养的病毒进行检测，结果发现培养前后病毒完全一样。

1.2 动物接种

目前，用于口蹄疫病毒鉴定的动物有：乳鼠、豚鼠、仓鼠、乳兔、鸡胚，以乳鼠、豚鼠最常用。从病料中将病原体分离提取后，接种于2～7日龄乳小鼠，在24h左右观察小鼠变化，结果小鼠行动不便，四肢僵直，呼吸急促，最终导致小鼠死亡。豚鼠也经常作为口蹄疫实验感染的实验动物，将口蹄疫病毒于豚鼠腿部的皮肤或在颈部皮内接种，第二日在接种部位可见到水泡，随后水泡慢慢消失，没有发现糜烂面，但是在口腔中发现水泡。

2 血清学诊断

2.1 凝集抑制试验

有些病毒具有凝集某种动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集试验，通过血凝与血凝抑制试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的抗体滴度。

2.1.1 正向间接血凝试验

该方法是指用灭活的口蹄疫病毒致敏绵羊红细胞，然后用其检测血清中抗体。曹旭[4]在内蒙古地区提取分离出牛O型口蹄病毒，并且制备成高免血清，并采用绵羊红细胞制成正向间接血凝液。利用制备的正向间接血凝液对内蒙古地区牛口蹄疫免疫血清进行检测，结果发现该方法能高效、快速检测免疫血清抗体。赵明娟等[5]用正向间接血凝方法与液相阻断ELISA方法对O型口蹄疫抗体合格率检测进行对比试验，发现正向间接血凝方法比液相阻断ELISA方法使用设备少，操作简单，价廉。

2.1.2 反向间接血凝试验

该方法是用针对口蹄疫病毒的特异性抗体致敏红细胞，然后用其检测样品中的口蹄疫病毒。李世军将口蹄疫病毒在BHK-21细胞分离培养后，并用猪O型口蹄疫病毒IgG抗体进行荧光标记，最后采用反向间接血凝试验成功检测出病毒所在位置。

2.2 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA作为一种新的诊断方法在近些年来得到飞速发展，经过许多研究者多年的努力，现已形成液相阻断ELISA、固相竞争ELISA以及间接夹心ELISA等多种ELISA诊断方法。

2.2.1 液相阻断ELISA

Hamblin等用液相ELISA方法与VNT对口蹄疫抗体检测比较试验，结果发现，由于病毒在液相状态下其抗原处于自然状态可以和血清更好的反应。所以，不用特定培养分离病毒比VNT更加安全、快捷，使得对于口蹄疫的诊断环境要求更加简便。在2005年，马军武等首次用液相阻断ELISA检测AsiaⅠ型口蹄疫。液相阻断ELISA可以快捷、准确、灵敏的检测出血清中抗体含量。该方法在临床实践中的应用将ELISA推上了一个新阶段。

2.2.2 固相竞争ELISA

固相竞争ELISA方法检测口蹄疫血清中抗体与液相阻断ELISA相比较其敏感性相似。2008 年林密[9]等建立了O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA 抗体检测方法，并用该方法对92份非口蹄疫区无免疫牛血清进行检测，发现血清抗体效价均低于1.32。由此，确立了判断O型口蹄疫血清抗体效价的标准值是大于或等于1.32。在与液相阻断ELISA相比较试验，得出固相竞争ELIA特异性要比液相阻断ELISA特异性高10.8%。

3 分子生物学诊断技术

该方法是指在特定的条件下，以被检病料中少量的病原遗传物质为模版，在体外迅速扩增该遗传物质的过程。该方法具有灵敏度高、省时、操作简便等特点，所以该方法被广泛用于口蹄疫的诊断。在1999年，我国科学家吴时友等[10]用PCR反应扩增110bp寡聚核酸片段，并由光敏生物素标记和TdT催化进行的3＇末端标记而成的寡聚核苷酸探针，在经过NC膜上斑点杂交试验可以检测出患病死亡动物体内的口蹄疫病毒。在1996年，朱彩珠[11]等用BHK-21细胞培养口蹄疫病毒、乳鼠传代口蹄疫病毒、猪水泡皮和牛舌皮等作为病毒材料，通过反转录聚合酶链式反应（RTPCR）技术快速、简捷的检测出牛O-P液中的口蹄疫病毒，在与常规的检测技术相比较试验中，RT-PCR比常规检测技术灵敏度提高了12倍左右。到2005年，包慧芳等[12]在口蹄疫病毒3D基因区设计一组特异的引物和探针并对其进行荧光标记实时定量RTPCR，可以快速检测口蹄疫病毒，且可对病毒进行定量检测，具有高度的特异性和实时性。这种定时定量的方法进一步完善和推动了PCR技术在FMDV检测中的应用。

[1]杨永钦.口蹄疫病毒适应于细胞培养的研究[J].中国畜禽传染病，1995，（82）：48-49.

[2]王光祥，尚佑军，陈江涛，等.仔猪心肌原代细胞培养及其对口蹄疫病毒敏感性研究[J].中国人兽共患病学报，2010，（10）：912-915.

[3]杨永钦，信爱国，李乐，等.口蹄疫诊断技术的研究与应用[J].云南畜牧兽医2001，29（1）：57-59.

[4]曹旭.口蹄疫正向和反向血凝诊断液的研究[D].内蒙古农业大学，2004.

[5]赵明娟.正向间接血凝试验（IHA）和液相阻断酶联免疫吸附试（LPB-ELISA）检测O型口蹄疫免疫抗体的对比[J].当代畜牧，2012，（12）：25-26.

[6]李世军.口蹄疫病毒的血清学检测与电镜观察[D].贵州大学，2006.

[7]Hamblin C，Bamett I T R，Hedger R S. A new enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）for the detection of antibodies against foot and mouth disease virus[J]. Immunol Methods，1986，（93）：123-129.

[8]马军武，周广青，靳野，等.应用液相阻断ELISA 检测口蹄疫AsiaⅠ型病毒抗体[J].中国兽医科技，2005，35（增）：375-377.

[9]林密，马军武，祁淑芸，等.O型口蹄疫病毒固相竞争ELISA 抗体检测方法的建立[J].中国预防兽医学报，2008，30（8）：627-630.

[10]吴时友.生物素标记的口蹄疫病毒cDNA探针的制备及其对口蹄疫病毒RNA检测的研究[J].畜牧兽医学报，1991，22（4）：365-370.

[11]朱彩珠，卢永干，邱孝高，等.应用反转录-聚合酶链反应检测口蹄疫病毒[J]..病毒学报，1998，14（3）：272-277.

[12]包慧芳，郭建宏，卢曾军，等.应用荧光实时定量RT-PCR方法检测口蹄疫病毒[J].中国兽医科技，2005，35（增）：388-389.

康桂英（1976-），女，内蒙古凉城人，硕士，主要从事寄生虫及寄生虫病的研究。

项目来源：内蒙古民族大学科学研究基金资助项目（项目编号：NMD1215）