左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞及OPG表达的作用

于志勇

（湖南省长沙市第八医院病理科，湖南 长沙 410100）

左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞及OPG表达的作用

于志勇

（湖南省长沙市第八医院病理科，湖南 长沙 410100）

目的 探讨左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞及OPG的表达作用，为临床预防骨质疏松提供参考。方法 以小鼠骨细胞MC3T3-E1成骨细胞为研究对象，用左旋肉毒碱对其表达进行干预，最后，以免疫组化法检测左旋肉毒碱干预前后OPG蛋白质表达水平的改变，分析左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞OPG的表达作用。结果 1 mmol/L左旋肉毒碱对小鼠成骨细胞无明显作用，10～100 mmol/L左旋肉毒碱能促进小鼠成骨细胞增殖，显著抑制人成骨细胞凋亡，增加小鼠骨密度。结论 左旋肉毒碱可通过促进MC3T3-E1成骨细胞OPG的表达，促进成骨细胞增殖，呈剂量依赖性和时间依赖性，并且左旋肉毒碱可抑制人成骨细胞凋亡，延长其存活时间。

左旋肉毒碱；MC3T3-E1；成骨细胞；OPG；骨质疏松

左旋肉毒碱（L-C）是人体细胞内普遍存在的一种基本成分，人体肝脏、肾脏可合成约1/4的左旋肉毒碱，其余通过食物摄取［1］。有报道表明，左旋肉毒碱可通过促进成骨细胞的表达来促进骨形成，另外，左旋肉毒碱也可对OPG（骨保护素，又称破骨细胞抑制因子）产生作用，以此来预防骨质疏松症。本次探究以小鼠骨细胞MC3T3-E1成骨细胞为研究对象，探讨左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞OPG的表达作用，分析左旋肉毒碱促进骨形成的作用机制，报道如下。

1 资料与方法

1.1 成骨细胞培养：在含有10%胎牛血清（FBS）、50 μg/mL抗坏血酸，50 μg/mL庆大霉素和50 U/mL青链霉素的培养基中传代培养小鼠成骨细胞MC3T3-El。保持温度37 ℃、湿度100%、CO2浓度5%。观察组以0.1～10 mmol/L左旋肉毒碱培养24 h，对照组加等量蒸馏水作为对照。

1.2 表型鉴定：将细胞接种于24孔板，第2天换含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的无血清α-MEM培养基培养24 h，再换不含BSA的无血清α-MEM培养基，分别以0、1、10、100 mmol/L左旋肉毒碱干预2 d后，PBS反复冲洗3次，超声粉碎裂解细胞，离心、取上清液、测定ALP活性，以骨钙素放射免疫试剂盒测定上清液中骨钙素含量（灵敏度为0.2 ng/mL）检测成骨细胞中OPG蛋白表达变化。

1.3 统计学分析：数据采用SPSS19.0统计学软件进行分析处理，计数资料以表示，用t检验，计量资料的比较用χ2检验，组间比较用单因素方差分析，检验水准取α=0.05，P＜0.05具有统计学差异。

2 结 果

10～100 mmol/L左旋肉毒碱促进人成骨细胞增殖。1 mmol/L以下左旋肉毒碱对人成骨细胞增殖无明显影响（与对照组相比，P＞0.05）。10 mmol/L以上剂量后，左旋肉毒碱使人成骨细胞增殖量随浓度递增（与对照组相比，P＜0.05）。另外，实验组1 mmol/L左旋旋肉毒碱可见细胞核浓缩，核裂解，大量凋亡细胞，随着左旋肉毒碱剂量增加，实验组凋亡细胞明显减少。

3 讨 论

人体骨吸收和再生之间的动态平衡维持着骨代谢的稳定，其形成和吸收的速率由成骨细胞和破骨细胞的数量、活性及存活时间来决定［2］。老年人及绝经后的妇女由于分泌、代谢等因素易导致成骨细胞减少、破骨细胞增加引起骨质疏松。左旋肉毒碱已经被证实可作为长链脂肪酸的载体，将期运送至线粒体内进行氧化功能，还可促进成骨细胞增殖和分化，增加骨密度预防骨质疏松。

本次探究以小鼠成骨细胞为研究对象，探讨左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞及OPG的表达作用，实验结果表明，10 mmol/L以上的左旋肉毒碱通过MC3T3-E1成骨细胞OPG蛋白的表达，促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞生成，从而提高骨密度。有文献报道，左旋肉毒碱是通过下调Caspase-3、Caspase-9的活化，来抑制成骨细胞凋亡的，从双方面降低了骨质疏松的发生［3］。说明左旋肉毒碱不仅可以促进成骨细胞增殖、还可以延长其生存时间，缓解其凋亡速率，另外，左旋肉毒碱对OPG表达的抑制作用可抑制破骨细胞生成，对骨重建及骨密度的增加具有重要意义。对老年人及绝经后的妇女，可显著改善其骨质量，降低骨折的发生率［4］。

综上所述，一定剂量的左旋肉毒碱可促进MC3T3-E1成骨细胞OPG的表达，刺激成骨细胞增殖，且其作用强度呈剂量依赖性和时间依赖性。另一方面，左旋肉毒碱可抑制人成骨细胞凋亡和破骨细胞生成，促进骨形成、减少骨量丢失。本次探究是提高动物实验证实其作用，具体将左旋肉毒碱应用于临床治疗，还有待进一步临床实验的证实。

［1］ 姚静，邓益峰，周振雷，等.鸡骨保护素（chOPG）编码区基因的克隆和序列分析［J］.农业生物技术学报，2006，14（5）:816-817.

［2］ 崔蓉蓉，谢辉，黄佼，等.左旋肉毒碱对人成骨细胞增殖和凋亡的影响［J］.中国骨质疏松杂志，2007，13（10）:681-682.

［3］ 杨宇，吴元华，郑雅楠•利用重叠延伸PCR技术进行DNA的人工合成［J］.安徽农业科学，2006，34（9）:1810-1811.

［4］ 张勇，杨彤涛，黄立军，等.人破骨细胞分化因子（ODF）的克隆和序列分析［J］.陕西医学杂志，2006，35（3）:269-270.

［5］ 于志勇，魏启幼.左旋肉毒碱对MC3T3-E1成骨细胞及去卵巢大鼠骨质疏松模型中OPG和RANKL表达的作用［D］.长沙:中南大学，2009.

［6］ 梁秋华，廖二元.左旋-肉毒碱对糖皮质激素诱导的骨丢失模型大鼠骨密度和骨微结构的影响［D］.长沙:中南大学，2009.

［7］ 张瑞娟，罗湘杭.牛磺酸和左旋肉毒碱协同抑制血管平滑肌细胞增殖和成骨分化［D］.长沙:中南大学，2011.

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1671-8194（2015）14-0045-01