氧化应激与肾脏细胞凋亡

综述与专论

氧化应激与肾脏细胞凋亡

皇甫冰,高继萍,杨霞,王裕,宋国华

(山西医科大学实验动物中心；实验动物与人类疾病动物模型山西重点实验室，山西 太原030001)

【摘要】氧化应激产生的活性氧(ROS)与细胞凋亡存在密切的关系。ROS可通过激活线粒体、Bcl-2家族、NF-κB及MAPKS家族、Caspase家族等途径引起细胞凋亡，细胞凋亡在肾脏疾病的发病过程中起着重要作用。本文就氧化应激在肾脏疾病发生发展中的作用及其诱导细胞凋亡的机制进行了综述。

【关键词】氧化应激；活性氧；肾细胞；细胞凋亡；

[基金项目]山西省卫生厅科技攻关项目(2011080)；山西省实验动物专项(2012k02)。

[作者简介]皇甫冰(1990-)，女，硕士研究生，主要研究方向:人类疾病动物模型，E-mail: bhuangfu@hotmail.com。

[通讯作者]宋国华(1973-)，女，博士，主要研究方向：人类疾病动物模型，E-mail: ghsongg@hotmail.com。

【中图分类号】R33【文献标识码】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.014

Oxidative stress and renal cell apoptosis

HUANG FU-bing, GAO Ji-ping, YANG Xia, WANG Yu, SONG Guo-hua

(Shanxi Medical University, Laboratory Animal Center, Shanxi Key Laboratory of Experimental

Animal Science and Hunman Disease Animal Model,Shanxi Taiyuan 030001，China)

Abstract【】Reactive oxygen species (ROS) resulting from oxidative stress have a close relationship with cell apoptosis. ROS induces cell apoptosis through activating different signaling pathways including mitochondria, Bcl-2, NF-κB, MAPKS and Caspases and so on. Cell apoptosis plays a significant role in the course of kidney diseases. In this paper, the function of oxidative stress in the development and progression of kidney diseases and apoptosis mechanism induced by oxidative stress are reviewed.

【Key words】Oxidative stress; Reactive oxygen species, ROS; Renal cell; Apoptosis

肾脏细胞凋亡一直是国内外学者研究的热点，在多种肾病模型和临床肾脏病理中均可观察到细胞调亡，其参与多种肾脏病理损伤的发生及发展[1-3]。在肾损伤的初期, 凋亡有利于清除过多的增生细胞而保护肾；而晚期的细胞凋亡加重了肾功能的恶化程度。氧化应激与肾脏细胞凋亡有着密切的关系，氧化应激产生的ROS可通过不同的途径诱导肾脏细胞凋亡。研究证实氧化应激及其诱导的细胞凋亡是慢性肾功能衰竭(CRF)[4]、肾缺血再灌注损伤(IRI)[5]、急性肾损伤(AKI)[6]、糖尿病肾病(DN)[7]的重要致病因素，在各种肾病的发病中起重要作用。本文就氧化应激及其诱导肾脏细胞凋亡的机制以及在肾损伤中的作用作一综述。

1氧化应激的原因和后果

活性氧分子(reactive oxygen species，ROS)是诱导细胞凋亡的重要因素，是外源性氧化剂或机体内氧化代谢过程产生的性质活泼的含氧化合物的总称，如超氧化物、过氧化氢、单线态氧和氢氧根阴离子等。机体在正常情况下会产生少量ROS，在自由基清除酶类和抗氧化剂的作用下能维持氧代谢平衡，对于激活转录因子、促进细胞增殖分化、调控某些生理活性物质和炎症免疫等具有广泛的生理意义。当细胞受到有害刺激后，ROS大量产生，破坏了机体氧化与抗氧化系统之间的平衡，最终导致氧化应激[8]，促进细胞凋亡甚至导致病理损伤。而研究显示多种肾病模型均处于氧化应激状态，细胞外刺激作用于线粒体导致其功能障碍，从而影响线粒体呼吸链中酶的活性，引起氧自由基的增多；线粒体活性氧的产生又可激活许多产生ROS的通路：糖酵解途径，多元醇途径(PP)，解偶联一氧化氮合酶(NOS)、黄嘌呤氧化酶途径、NADPH氧化酶和糖基化终产物途径(AGE)[9-11]。实验动物模型肾组织内自由基清除剂和抗氧化酶SOD、GSH-Px水平和活性降低，也可能导致ROS水平增多[12]。活性氧通过与细胞内的脂质、核酸、蛋白质发生反应，导致机体组织脂质过氧化、DNA氧化损害和细胞内蛋白变性，对细胞造成损伤；ROS还可作为细胞内信使，活化许多信号传导通路如细胞凋亡通路,间接导致细胞损伤[13]，细胞损伤使细胞内产生更多ROS。可见，氧化应激是肾脏损伤的重要病生机制，参与了肾脏疾病的发生发展。

2细胞凋亡与氧化应激损伤

细胞凋亡(apoptosis)又称为细胞的程序性死亡，是指为维持内环境稳定，由凋亡相关基因调控的细胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，在形态学和生物化学方面有别于细胞坏死。在氧化应激情况下，过多ROS导致细胞损伤，机体在应对 ROS 损害时形成一套复杂的氧化应激应答系统。我们猜想细胞凋亡也是其中一种应答机制，通过清除过多的增生细胞而防止肿瘤的形成，清除受损、危险的细胞而不对周围细胞产生危害，是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程，以减轻细胞发生的氧化应激损伤。但细胞凋亡是细胞外界环境因素与细胞自身综合作用的结果，不仅有特定基因控制, 还受细胞周围的刺激因素的诱导和抑制, 外源性因子亦可以通过一定的信号通路发挥刺激作用[14]。在ROS积聚的情况下，除了主动的细胞凋亡外，ROS能通过激活一系列信号通路来诱导细胞凋亡，导致细胞凋亡失调而使得细胞过度凋亡，细胞过度凋亡将会引发自身免疫疾病和炎症，与多种急慢性疾病如慢性肾功能衰竭、急性肾损伤等有关[15]。多项研究也表明，无论在正常生理或病理条件下，肾脏细胞均存在着凋亡现象，病理条件下细胞发生过度凋亡。综上所述，氧化应激产生的ROS造成细胞损伤，细胞损伤又导致ROS的过量积聚，积聚的ROS诱导细胞过度凋亡，细胞凋亡进一步加剧了氧化应激损伤。

3氧化应激诱导肾脏细胞凋亡的机制

3.1线粒体与肾脏细胞凋亡

内源性和外源性有害刺激都可以改变线粒体的结构和功能，诱发细胞氧化应激，激活线粒体起始的内源性凋亡途径。研究发现，细胞毒剂如阿霉素[16]、砷[17]、脂多糖[18]、镉[19]等都能够诱导肾脏细胞凋亡，并且其凋亡依赖于线粒体凋亡途径。de Arriba[20]等以环孢霉素A(CsA)处理的猪肾小管上皮(LLC-PK1)细胞为实验对象，进一步探讨了线粒体在LLC-PK1细胞凋亡中的作用，实验发现CsA破坏线粒体结构，引起线粒体通透性转化孔(MPTP)的开放、线粒体膜电位的下降、ROS含量增加及促进线粒体的分裂等一系列与细胞凋亡相关事件的发生。MPTP与细胞凋亡密切相关。MPTP是跨越线粒体外膜和内膜的通道，由内膜蛋白如腺嘌呤核苷酸易位子(ANT)、亲环素D(cyclophilin D)及外膜上的孔蛋白电压依赖性阴离子通道(VDAC)构成。MPTP周期性开放，以维持线粒体内电化学平衡及稳定状态。过多ROS通过氧化MPTP的内膜蛋白ANT的相邻巯基来诱导MPTP的开放，MPTP的不可逆过度开放会导致线粒体跨膜电位(△Ψm)的下降甚至完全崩解[21]。线粒体跨膜电位一旦耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。而MPTP的开放还会导致线粒体内ROS的过度生成及基质的高渗性，导致促凋亡蛋白如细胞色素c(Cyt-c)从线粒体向细胞质释放，加速细胞的凋亡[22,23]。Zhou[24]用20 μM镉诱导猪肾小管上皮细胞(LLC-PK1)凋亡的实验，观察到伴随着△Ψm的下降，细胞浆内的细胞色素c明显增加，能被抗氧化剂NAC有效抑制。Cyt-c的释放是细胞凋亡的关键。Cyt-c从线粒体膜间隙释放到细胞浆内，在ATP/dATP的协同作用下，与凋亡蛋白酶活化因子( Apaf-1)及Caspase-9酶原结合而形成凋亡复合体，Caspase-9酶原活化并激活下游的Caspase-3和Caspase-7，最终导致细胞凋亡。最近研究显示造影剂可诱导肾小管上皮细胞中调控细胞凋亡、增殖的转录因子，如FOXO3a、STAT3的活化和失活[25],FOXO3能通过使线粒体呼吸链解耦连而促进ROS的产生[26]。综上所述，线粒体在氧化应激诱导肾脏细胞凋亡中发挥着关键性作用，是细胞凋亡调控的活动中心。

3.2Bcl-2家族与肾脏细胞凋亡

Bcl-2基因家族是介导细胞凋亡的重要因子，在细胞凋亡基因调控过程中起重要调节作用。Bcl-2和Bax是该家族中最具代表性的抗凋亡因子和促凋亡因子。Bcl-2属原癌基因，编码26×103的线粒体膜蛋白，是最重要的凋亡抑制基因，Bax表达水平增加可拮抗Bcl-2的作用,促进细胞凋亡。许多研究发现ROS可能通过增加Bax/Bcl-2的表达比率来启动肾脏细胞凋亡[27-29]。Yang等[30]发现无论在mRNA还是蛋白质水平, Bax/Bcl-2的比值与肾脏细胞凋亡都有密切联系。近来，Yang等[31]利用免疫组化和逆转录-聚合酶链式反应测定80只雄性大鼠的Bax/Bcl-2蛋白质表达和mRNA表达，结果发现 NaF组、Na2SeO3组均明显增高，而NaF+Na2SeO3c组显著降低，提示氟化钠可通过上调Bax/Bcl-2的比值促使肾脏细胞凋亡，硒通过调节Bcl-2和Bax的表达来抑制凋亡。因此，Bcl-2和Bax的比值可决定细胞凋亡的敏感性。Bcl-2家族成员主要通过形成同源或异源二聚体来完成对细胞生存和死亡的调控作用。当Bax大量表达时, 形成的大量Bax-Bax同源二聚体会导致线粒体功能的丧失、促凋亡因子从线粒体调控性地释放和下游caspase的活化，从而诱导和促进细胞凋亡；而Bcl-2的增多会诱导并加剧Bax二聚体的解聚,与Bcl-2形成的异源二聚体Bax-Bcl-2比Bax-Bax更为稳定[32]，凋亡被抑制。

Bcl-2基因是目前Bcl-2基因家族中最受关注的基因之一,主要定位于线粒体膜和内质网上[33]。Bcl-2对细胞凋亡的负性调节机制可能为：1. 线粒体：抑制线粒体内ROS的产生；保护线粒体膜的完整和阻止MPTP的开放，阻断Cyt-c、AIF的释放和caspase-9、caspase-3的活化[34，35]；提高线粒体的容许负荷，使线粒体对Ca2+的耐受力增强[36]；2. 内质网：抑制内质网内ROS的产生和Ca2+的外渗[37]；3. 氧化还原机制：上调抗氧化酶活性，提高细胞的谷胱甘肽(GSH)水平，增加细胞总的抗氧化能力[38]；4. 与Bax的作用：阻止Bax向线粒体的迁移和聚集，通过形成异源二聚体抑制Bax的促凋亡作用[39]。Bax通过与线粒体膜上的VDAC结合而促进MPTP开放，诱导凋亡[40](图1)。Métrailler-Ruchonnet等[41]对高氧诱导小鼠成纤维细胞(L929)凋亡中Bcl-2的保护机制进行了研究，证明过量表达的Bcl-2能够通过影响线粒体凋亡通路和提高细胞内的抗氧化水平来抑制细胞凋亡。但肾脏细胞有关这方面的研究还较少，Bcl-2对肾脏细胞凋亡的调节机制有待进一步探讨。

3.3NF-κB与肾脏细胞凋亡

NF-κB是细胞内广泛存在的多向性核转录因子，可以将凋亡信号传递到细胞核,调控细胞的调亡。Li等[42]研究发现茶多酚可抑制TLR4/NF-κB p65信号通路，以保护肾小管上皮细胞免受肾缺血再灌注引起的细胞凋亡。Xu[43]用益母草碱处理脂多糖诱导的急性肾损伤大鼠，经ELISA和Western blot检测发现脂多糖能够引起IκBα磷酸化、p65蛋白易位和TNF-α及IL-6表达增加，结果表明益母草碱可以抑制ROS调节的NF-κB信号通路来发挥保护作用。可见NF-κB信号通路在肾脏细胞凋亡中发挥重要作用。NF-κB在正常细胞的胞质中以p50-p65异二聚体的形式与抑制亚基IκB结合处于失活状态。Ha等[44]报道,外源性的过氧化氢能够引起高糖环境中大鼠肾系膜细胞NF-κB活性的增高,且能被抗氧化剂抑制,提示ROS与NF-κB的活性增高有关。活性氧激活NF-κB的机制：ROS通过抑制磷酸酶的活性，可以提高蛋白激酶C(PKC)活性，促进IκB磷酸化并被泛素化降解，导致NF-κB与IκB解离而活化[21]；ROS通过共价修饰NF-κB中的组氨酸、半胱氨酸等氨基酸残基来改变NF-κB的活性[45]。活化的NF-κB暴露出核定位信号并转位入核，与核内特定靶基因的特异序列(GGGACCTTTCC)相结合后迅速诱导多种基因的表达[46]。邓超男等[47]用免疫组化和实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测肾组织肾小管上皮细胞中NF-κBp50、NF-κBp65及IκB的表达，p50、p65表达强度随染氟剂量增加逐渐降低，IκB则呈逐渐增加趋势，结果表明NF-κB相关基因表达减少引起的肾小管上皮细胞凋亡是慢性氟中毒大鼠肾脏病变的机制之一。近年的研究表明, NF-κB具有抑制细胞凋亡和促细胞凋亡的双向作用。ROS通过调控NF-κB的活性决定正负性调节[48,49]：ROS的轻度增加利于NF-κB的激活，抗细胞凋亡；ROS的过度增高阻止NF-κB的激活，促细胞调亡。细胞内的氧化还原水平决定NF-κB的激活和其转录功能的发挥。细胞核内NF-κB的p50亚基能够与靶基因结合，但当p50被过量的ROS氧化后不能维持还原状态，减弱了NF-κB与DNA的结合能力，抗凋亡因子的表达下调，促进了细胞凋亡的发生[21]。研究显示活化的NF-κB转录凋亡相关基因从而诱导细胞凋亡,Grove[50]和Qin[51]研究发现NF-κB能激活凋亡基因Fas、c-myc及TNF-α，使基因表达增加从而引起细胞凋亡。近几年的研究揭示了ROS调节NF-κB活性的机制,证实NF-κB参与并调控近200种基因转录[52],在细胞凋亡中起到了十分重要的作用。

3.4MAPKS家族与肾脏细胞凋亡

MAPKS家族在肾脏细胞凋亡中发挥重要作用。丝裂原活化蛋白激酶(MAPKS)家族，包括细胞外信号转导蛋白激酶(ERKs)、C-Jun氨基末端激酶(JNKs)和p38激酶(p38MAPK)等亚族。许多研究证实丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)介导了多种细胞外刺激导致的肾脏细胞凋亡[53-55]。 Gao[56]等发现花青素通过抑制ERK通路的活性可减弱顺铂诱导的HK-2细胞凋亡。Guo[57]等研究证实p38MAPK通路参与三聚氰胺诱导的大鼠肾上皮细胞凋亡。激活的MAPK将外界信号传导到细胞核内,参与细胞的分化、增殖和死亡(坏死或凋亡)等多种生理反应的过程，而大量实验显示ROS能够导致MAPKs(ERK、p38MAPK、JNK)信号通路的激活[55][57-59]。MAPK家族激活的级联反应相似,都通过保守的三级酶促反应,MAPKKK→MAPKK(MKK)→MAPK[60]。MKK4和MKK7可激活JNK，MKK3、MKK6以及MKK4 可激活p38，MKK1和MKK2 可激活ERK[61]。郝卯林等[62]通过制作稳定高血糖糖尿病模型和波动高血糖糖尿病模型，并用免疫组化法和Western blot检测肾脏JNK蛋白表达, 发现肾小管上皮细胞胞质JNK蛋白的磷酸化水平均明显高于正常对照组,且波动高血糖组较持续高血糖组变化更为明显, 提示血糖波动可能作为一种刺激信号,会引发较单纯高血糖更加严重的氧化应激反应,通过激活JNK,进而促进细胞凋亡。ROS能够激活凋亡信号调节激酶1(ASK1)[63,64]。ASK1是JNK和p38通路中的一种MAPK激酶激酶，在生理状态下与Trx(硫氧化还原蛋白)结合不具有激酶活性。ASK1主要通过两种方式调节MAPKS信号通路，一方面氧化应激导致Trx的二聚化，ASK1与其分离而获得激酶活性，另一方面ROS直接氧化ASK1而形成同源二聚体，从而获得激酶活性[23]。活化的ASK1磷酸化激活MAPK，再激活蛋白激酶2与3，进而磷酸化低分子量的热休克蛋白，最终激活caspase级联反应，导致细胞凋亡。而Jeffrey等[65]在 PHN大鼠膜性肾病模型中发现ERK抑制剂加重肾小球足细胞中DNA的损伤，提示ERK活化可能在肾小球足细胞中起到保护细胞的作用。MAPKs成员对氧化应激诱导的细胞凋亡过程中起正性或负性作用还未有定论,对此还存在很多争议。MAPKs通路在不同肾病模型的发病机制中发挥的不同作用仍需进一步研究。

3.5caspase家族与肾脏细胞凋亡

Caspase级联反应是多条凋亡通路的汇聚点，调控凋亡的最终执行。Caspases是一组存在于细胞质中的具有相似结构的胱冬肽酶，均为半胱氨酸蛋白酶，专一切割蛋白质分子中的Asp-X肽键，导致细胞凋亡。ROS与caspase之间存在双向作用，ROS诱导caspase的级联反应，而caspase的激活也可能提升细胞内ROS水平。研究发现线粒体凋亡通路中的细胞色素c释放之后又产生了新的ROS，线粒体膜蛋白和线粒体电子传递链成分都是caspase的底物[66]。Lu等[67]用对氨基苯胂酸诱导肾上皮细胞凋亡和氧化应激，并用Western blot检测发现活性caspase-3、caspase-9表达增加，结果显示caspase-3、caspase-9信号通路参与了细胞凋亡。氟化钠处理的大鼠均有肾脏细胞凋亡，免疫组化检测均可观察到中氟组和高氟组中caspase-3、caspase-8、caspase-9的光密度值高于对照组，表明caspase调节的线粒体通路和死亡受体通路参与了氧化应激诱导的肾脏细胞凋亡[68,69]。胱冬肽酶参与两条细胞凋亡通路：一条是线粒体通路，由细胞色素c介导，激活caspase-9酶原启动级联反应；另一条是死亡受体通路，FasL蛋白可发出死亡信号，caspase-8酶原活化启动级联反应。两条通路均有caspase-3的参与。有研究发现，定位于内质网的caspase-12的激活独立于死亡受体、线粒体传递的凋亡信号，提示caspase-12可能参与内质网介导的新凋亡[70]。

3.6各机制之间的联系

氧化应激诱导细胞凋亡的机制中，线粒体起始的内源途径、Bcl-2家族的调节、NF-κB、MAPKS家族及caspase激活等并不是相互排斥的，各机制之间有紧密的联系。外界刺激时, MAPKS家族成员JNK、P38MAPK可以将凋亡信号传递给线粒体。线粒体接受凋亡信号,释放细胞色素c,活化特定的caspase蛋白酶, 诱导细胞凋亡。线粒体外膜的透化(MOMP)引起细胞色素c的释放是一关键环节，主要受Bcl-2家族蛋白的调控[71]。Bcl-2家族通过促凋亡和抑凋亡因子调节线粒体介导的凋亡过程,并参与线粒体、死亡受体通路间的串话[72]。Bcl-2又受到JNK的调节，通过磷酸化Ser-70而抑制其抗凋亡作用[73]。NF-κB可促进Bcl-2 家族中抗凋亡因子的表达，发挥降低线粒体膜的通透性、抑制细胞色素c释放的抗凋亡作用[74]。研究表明，NF-κB可通过抑制JNK激活而起到抗细胞凋亡的作用[75]。MAPKs诱导凋亡依赖caspases活性。caspase-3可裂解定位于线粒体的Bcl-2产生的蛋白质分子进而诱导凋亡[72]。线粒体通路、死亡受体通路及内质网通路均有caspase的激活。综上所述，各机制共同参与细胞凋亡。

4结语

氧化应激产生的大量ROS不仅可直接对细胞造成损伤，也可通过多种不同途径诱导细胞过度凋亡造成细胞损伤，引起不同程度的肾损伤，氧化应激和肾脏细胞凋亡共同参与了肾脏疾病的发生发展过程。了解氧化肾损伤中的细胞凋亡机制对今后肾病的预防和治疗工作、开发和利用抗氧化活性物质具有重要意义，减少ROS的产生、提高肾脏的抗氧化能力及阻断ROS 产生，可能是预防和治疗肾病的有效途径。

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〔修回日期〕2014-11-16