用酶联免疫试剂盒检测猪尿中的沙丁胺醇

樊秀敏

(辽宁省朝阳市建平县畜产品安全监察所,辽宁建平 122400)

用酶联免疫试剂盒检测猪尿中的沙丁胺醇

樊秀敏

(辽宁省朝阳市建平县畜产品安全监察所,辽宁建平 122400)

沙丁胺醇俗称瘦肉精，人食用含有瘦肉精残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、恶心、呕吐、发烧等症状，中国已明令禁止其用于食品动物。沙丁胺醇酶联免疫试剂盒具有方便、快速、灵敏等特点，适用于大批量样品筛查。

酶联免疫吸附法 检测 沙丁胺醇

随着我国经济水平的不断提高及生活质量的不断改善，人们的膳食结构发生了变化，动物性食品所占的比例在不断增加。为了满足人们对动物性食品需求的增长，大量的兽药被应用于现代畜禽生产的许多环节，造成动物性食品中兽药残留，使人民的身体健康和生命安全受到影响，2006年发生的“苏丹红”红心鸭蛋事件、“瘦肉精”中毒事件都是这个问题的有力证明。

瘦肉精是一类动物用药，有数种药物被称为瘦肉精，例如沙丁胺醇、莱克多巴胺及克伦特罗等。将瘦肉精添加于饲料中，可以提高胴体瘦肉率，降低生产成本。人食用含有瘦肉精残留的动物性食品，会出现肌肉震颤、心悸、过敏、头痛、恶心、呕吐、发烧等症状，中国已明令禁止其用于食品动物。

检测瘦肉精的常用方法有：高效液相色谱法、气质联机法和酶联免疫吸附法，目前酶联免疫吸附法是最常用最适合的检测方法。

1 实验前的准备

1.1 准备样品

随机抽取代表性样品（猪尿）41个，每个样品抽取约100ml，平均分成3份，每份约30m l，分装于样品瓶中密封，用记号笔写上相应顺序编号。其中两份由抽样人员带回用于检验和留样用，另一份封存于被抽检单位，作为对检验结果有争议时复检用。检测前猪尿如果混浊可离心5min。

1.2 试剂盒

沙丁胺醇酶联免疫试剂盒（96孔）。北京维德维康生物技术有限公司生产。

1.3 设备和实验耗材

冰箱、离心机（4000g）、百得单、双道移液枪、计时器、洗板机、酶标仪（检测波长450nm，参考波长630 nm）、打印机、电脑、离心管、离心管架、枪头盒、枪头、加样槽、去离子水、吸水纸、记号笔。

1.4 试剂盒回温

从冰箱冷藏区取出试剂盒，将盒内各组分放在实验台上恢复至室温23℃～27℃。

1.5 添加阳性对照

用移液枪取8.1ppb浓度的标准品工作液100μl，猪尿305μl（阴性对照品），将二者放在离心管中混匀用记号笔作标记后，放在离心管架上，使之成为2ppb浓度的阳性对照品，用于计算阳性对照回收率。

2 检测步骤及注意事项

（1）取出酶标板条固定在酶标板架上，做双孔平行，记录标准品和样品的位置。检测样品数量较少时，将剩余的板条立即用自封袋密封后放置于冰箱冷藏区。整块板条最好一次用完，剩余板条有时因各种原因准确度降低。

（2）在标准品孔内依次加入标准品工作液（0、0.1、0.3、 0.9、2.7、8.1ppb）20μl，在样品孔内依次加入阳性对照品20μl，阴性对照品20μl，其他待测样品（猪尿）20μl。每次加完两个平行孔后都要更换枪头，防止交叉污染。

（3）每孔加入80μl抗体-酶标Ⅱ抗混合工作液（1份沙丁胺醇酶标Ⅱ抗浓缩液与10份沙丁胺醇抗体工作液充分混匀，配制后要立即使用！），加混合工作液时，不要让枪头沾染孔底的液体。

（4）用盖板膜盖好酶标板，轻轻用指尖磕碰酶标板四周10s，充分混匀，室温（23℃～27℃）下避光反应30min。

（5）配制洗涤工作液，1份浓缩洗涤液加19份去离子水。

（6）把酶标板上的盖板膜揭开，倒掉孔中的液体，在每孔中加入260μl洗涤工作液，浸泡15～30s后倒孔中洗液，再重复清洗3次。（这一步也可用洗板机清洗酶标板）

（7）最后一次清洗后，倒掉孔中洗液，将酶标板倒放在吸水纸上，抓紧酶标板四周轻轻在吸水纸上拍打至拍干。（如果此时孔底有气泡，可用干净的枪头将气泡戳破，戳不同孔底的气泡应更换枪头）

（8）拍干酶标板后，立即在每孔中加入100μl底物A、B混合液（按1：1比例混合在加样槽中，混合液在5min内使用，不能使用金属盛装、搅拌试剂！）。

（9）用盖板膜盖好酶标板，轻轻用指尖磕碰酶标板四周10s，充分混匀，室温（23℃～27℃）下避光反应15～20min。

（10）把酶标板上的盖板膜揭开，每孔中加入50μl终止液，轻轻用手指尖磕碰酶标板四周10s，充分混匀。

（11）终止后5min内，将酶标板放在酶标仪的载板架上，用酶标仪在双波长450nm、630 nm下读取酶标板吸光度值，并将数值打印出来。

3 计算阳性对照回收率

利用电脑r-biopharm数据分析软件，把测得的数值按一定顺序和要求手工录入，软件自动对结果进行分析，同时绘制标准曲线并得出所有检测样品中沙丁胺醇的含量。

回收率（%）=（实测阳性对照浓度—实测阴性对照浓度）÷添加浓度（2ppb）×100%

用此试剂盒按上述方法回收率范围为75%～105%，如果回收率达不到此要求，应该从各个环节入手，细心查找疏漏，以保证检测结果的准确性。

4 讨论

4.1 试剂盒的贮存

试剂盒贮存于2℃～8℃环境中，抗体和酶标Ⅱ抗在常温下容易变性。

4.2 加样

加样时应用移液枪把液体物质加在酶标板孔的底部，可用左手轻轻扶住移液枪的中部，避免将液体加在孔壁上部，并防止液体溅出及气泡产生。加抗体-酶标Ⅱ抗混合工作液、底物A、B混合液和终止液时，可将试剂倒在加样槽中，用定量多道移液枪加样，提高速度，节省操作时间，减少实验误差。

4.3 保温

实验中的保温避光反应步骤，是抗原抗体反应的完成过程，需要有一定的时间和温度。因为抗原与抗体结合的机会不均等，只有贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触，这是一个逐步平衡的过程。

4.4 洗板

洗板在这个实验过程中是很关键的一步。酶联免疫吸附法就是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，通过洗涤以清除残留在板孔中没结合的物质。如果洗涤次数不够、注入的洗涤液量不足或洗板间隔太久都会直接影响检测的最终结果，严重者使实验失败。

樊秀敏（1977-），毕业于中国农业大学，于1998年至现在一直在建平县畜产品安全监察所工作。