人诱导多能干细胞在药物早期毒性评价中的应用

赵增明，何俊，束玉磊，赵君，彭双清

（军事医学科学院疾病预防控制研究所毒理学评价研究中心，北京100071）

人诱导多能干细胞在药物早期毒性评价中的应用

赵增明，何俊，束玉磊，赵君，彭双清

（军事医学科学院疾病预防控制研究所毒理学评价研究中心，北京100071）

人诱导多能干细胞与人胚胎干细胞相似，在体外可分化为各种类型的体细胞，其来源充足，可针对个人或某种疾病取材，为药物早期毒性评价体外替代方法提供了一个新的可选细胞模型。目前，利用人诱导多能干细胞获得的心肌细胞用于药物引起的心率改变、QT间期延长和心肌损伤等心脏毒性评价；利用其获得的神经细胞，结合高通量、高内涵技术及电生理学技术，可用于药物引起的神经突出生长异常、电生理改变及神经发育毒性评价；利用人诱导多能干细胞可获得个体特异性的大量肝细胞，具有较高的细胞色素P450酶活性，能够比较真实的反映人肝细胞的代谢特征，用于评价药物肝细胞毒性；人诱导多能干细胞具有多能性，在体外可分化为外、中和内胚层，具有用于发育毒性评价的可能性，对三胚层相应标志分子的检测有助于发育毒性评价终点的确立；人诱导多能干细胞还可用作3D培养的种子细胞，构建三维立体组织和器官模型，用于药物早期毒性评价，进一步缩小细胞水平与体内水平评价结果的差异。

诱导多能干细胞；药物评价；药物毒性

传统药物安全性评价的手段是将大剂量受试物给予大量实验动物，观察其毒性效应，然后将实验结果外推到人。在由动物实验外推到人的过程中存在诸多问题，如种属间差异、遗传背景差异［1-2］、作用机制差异和实验周期长等。特别是在发育毒性、心脏毒性、肝毒性和免疫毒性等研究领域存在明显的种属差异［2］。因此，建立安全、有效的动物替代模型是毒理学的研究方向之一。近年来，人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSC）的出现为毒理学体外替代方法提供了一个新的可选细胞模型。

1 人诱导多能干细胞概述

hiPSC是人的体细胞经重编程后获得的具有类似于人胚胎干细胞（human embryonic stem cells， hESC）生物学特性的细胞。2006年Takahashi等［3］首次利用逆转录病毒载体将4种转录因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4转染小鼠皮肤成纤维细胞，使其转化成具有自我更新能力和分化潜能的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSC），以获得嵌合体小鼠，而可获得来源于iPSC的克隆小鼠，这些都说明iPSC具有与ESC相似的生物学特性，2007年他们又成功地将人皮肤成纤维细胞诱导为iPSC［4］。如今，获取iPSC的技术日益成熟，而且诱导转化效率不断提高，培养条件不断优化［5-7］。包括人在内的各种类型的体细胞（如小鼠肝细胞、小鼠胃/肠上皮细胞、胰腺β细胞、淋巴细胞、神经干细胞、人表皮成纤维细胞、人角质细胞、人骨髓间充质细胞、人脂肪干细胞、人口腔黏膜细胞和人外周血细胞等）［3,5,8-9］均可成功诱导为iPSC。Park等［9］将10种不同遗传疾病患者的体细胞诱导为患者特异的iPSC系；Liu等［10］获得了范科尼贫血症患者特异的不含外源基因的iPSC，用于范科尼贫血症发病机制及治疗的研究。由于转录因子c-myc具有一定的致癌性，而且将外源基因插入细胞基因组，有可能引起基因组不稳定及影响其他基因的表达，所以人们研发出多种方法制备不含外源基因的iPSC（transgene-free iPSC），如基于慢病毒载体的［11］、基于piggyBac转座子的［12］、基于Cre/loxp系统的［13］、基于非整合游离腺病毒载体的［14］和基于温度敏感的仙台病毒载体［15］等。利用这些方法制备的hiPSC与hESC具有更大的相似性，为iPSC应用于药物研发及药物安全性评价提供了强有力的技术支持。值得一提的是，利用外周血制备iPSC，具有容易采集、无痛苦、操作简便和容易接受优点，Trokovic等［16］创建了一种利用外周血单核细胞大规模快速制备iPSC的方法，只需要大约2周时间即可获得不含外源基因的iPSC细胞系。然而，尽管iPSC的制备技术有了飞速发展，依然存在许多问题有待解决，主要是iPSC制备过程的标准化以及不同iPSC细胞系之间的差异问题［17］。

由于hiPSC与hESC具有相似的生物学功能，因此检测方法一致。主要包括自我更新能力及多向分化潜能。自我更新能力主要是检测干细胞标志基因的表达，如OCT-4，SOX-2，NANOG，SSEA4，TRA-1-60和TRA-1-81等的表达；多向分化潜能主要是干细胞在体外向中胚层、外胚层和内胚层三胚层细胞形成能力，以及裸鼠体内畸胎瘤形成能力的检测。

2 hiPSC作为药物安全性评价载体的优点

目前，用于药物安全性评价的细胞系主要有以下3种，有限细胞系、连续细胞系和干细胞系。有限细胞系难以获得（如肝细胞和神经细胞等），变异性大，只能进行有限的几次传代增殖；连续细胞系（人永生化细胞系）的生物学特性已经异化，与人体正常细胞差别很大，如肿瘤细胞系已丧失了正常的增殖分化调控能力；而ESC在体外可长时间培养传代，具有正常二倍体核型，能够分化形成各种成体细胞，是药物研发及安全性评价的较好动物替代模型。

hESC的主要缺点是来源具有一定的局限性，其来源于人胚胎发育过程中囊胚内细胞团，取材存在一定的道德伦理问题。iPSC弥补了上述不足，hiPSC具有与hESC类似的生物学特性，具有自我更新能力及多向分化潜能［4］。hiPSC来源充足，可以针对不同人、不同部位的组织进行取材，然后分离培养细胞，经特定转录因子诱导产生hiPSC，可在体外长时间培养，多次传代并且保持正常核型及分化潜能，而且取材过程不存在道德伦理问题，应用hiPSC可以获得疾病特异的靶细胞用于药物筛选及安全性评价［18］。因此，利用hiPSC构建药物安全性评价模型，可以实现药物研发及安全性评价的个性化［19］，提高药物治疗、药物研发的针对性，并且可以避免动物实验带来的种属差异［20］，降低药物研发费用，缩短研发周期，是药物大规模筛选的理想平台。

3 hiPSC在药物心脏毒性评价中的应用

由于人源心肌细胞不易获得，而hiPSC来源的心肌细胞在体外可大量获得，因此，hiPSC来源的心肌细胞在心脏毒性评价中具有广阔的应用前景。Lim等［21］利用组蛋白去乙酰化抑制剂曲古抑菌素A（trichostatin A）、激活蛋白A（activin A）及骨形成蛋白4处理拟胚体，可以显著提高由拟胚体向心肌细胞的分化，利用该方法获得的心肌细胞可以很好的反映出心肌特异的基因转录与蛋白表达，经异丙肾上腺素和卡巴胆碱处理后，可表现出心肌特异的钙离子循环。这些结果表明，hiPSC来源的心肌细胞可用于心脏疾病的病理生理学研究、药物研发、药物评价以及心肌移植等。Sirenko等［22］利用hiPSC来源的心肌细胞，在384孔板中，结合高通量筛选技术，对131种已知心脏毒性药物进行了心脏毒性评价，发现心肌细胞的收缩率和峰型可以很好的反映化合物心脏毒性；Harris等［23］利用hiPSC来源的心肌细胞，发现多管电极阵列技术，能够很好的反映药物的心脏药理学及电生理学功能，该技术提供了一种可信的、廉价的体外心脏毒性评价方法；Navarrete等［24］利用hiPSC来源的心肌细胞结合微电极阵列技术，对药物引起的心率失常进行药物筛选；Nozaki等［25］利用hiPSC来源的心肌细胞评价药物引起的心脏QT间期延长；Eldrige等［26］的研究显示，ErbB信号通路在心肌细胞存活及功能完整性方面具有重要作用，他们利用ErbB信号通路的抑制剂及激活剂处理hiPSC来源的心肌细胞，发现可以减缓或促进由多柔比星导致的心肌损伤，进一步提示hiPSC来源的心肌细胞可用于药物的心脏毒性评价。

4 hiPSC在药物神经毒性评价及机制中的应用

hiPSC来源的神经细胞在功能与表型上与人成熟的神经细胞十分相似，胞体和神经突起明显，能够作为人神经细胞的体外模型，而且hiPSC来源的神经细胞可以大量的获得，能够满足高通量、高内涵检测的要求。目前，国内外的研究人员已经尝试将其应用于药物神经毒性评价及神经毒性研究。Sirenko等［27］采用高通量成像与分析系统评估hiPSC来源的神经细胞的多种表型，他们优化了hiPSC来源的神经细胞在384孔板的培养、染色和成像的方法并将其标准化，该方法可以高通量检测神经突出生长及分支情况、细胞数量与活性、线粒体密度及膜电位等，他们利用该系统检测了一系列的神经毒性物质以确定其稳定性和可靠性，结果均呈现出较好的量效关系，说明该系统能够用于神经毒性的高通量高内涵筛选。Odawara等［28］利用hiPSC来源的神经细胞结合微电极阵列技术，测定神经细胞电生理信号，进行神经功能研究及药物筛选。Whitemarsh等［29］的研究揭示，hiPSC来源的神经细胞表达吸收肉毒菌毒素的分子靶标，表明hiPSC来源的神经细胞可以有效地替代动物实验用于肉毒菌毒素的神经毒性评价。Pallocca等［30］利用干细胞源的神经细胞进行神经发育毒性评价，结果表明，与转录组学比较miRNA（如miR-302b，miR-367,miR-372,miR-196b及miR-141等）表达模式的改变可以更简单地预测神经发育毒性相关信号通路。在退行性神经疾病发病机制研究方面［31-33］，利用患者特异的hiPSC来源的神经细胞可以在体外模拟退行性神经疾病的表型，为进行机制研究与药物研发提供了良好的细胞模型。Ryan等［34］利用帕金森病患者特异hiPSC来源的神经细胞进行发病机制研究，揭示有关的MEF2C-PGC1a信号通路与帕金森病密切相关，并指出MEF2CPGC1a信号通路可能为帕金森病潜在治疗靶点；Muratore等［35］利用hiPSC来源的神经细胞对家族性阿尔茨海默病发病机制进行了研究，表明家族性阿尔茨海默病存在APPV717I的突变导致APP的剪接发生改变及Tau蛋白表达发生变化。

5 hiPSC在药物肝毒性评价中的应用

药物所致肝损伤是上市药物撤市的主要原因之一，由于肝细胞功能存在明显种属差异，动物实验不能准确反映人体肝细胞的药物代谢反应，因此，细胞实验广泛应用于肝毒性评价。目前所用的几种肝毒性评价的细胞系（如HepG2）都不能较好地反映人肝细胞的代谢特征，人原代肝细胞虽为最理想的肝毒性评价细胞，但其分离较困难，且体外培养时间短，无法进行长期肝毒性评价。利用hiPSC技术可以获得个体特异性的大量肝细胞，其反映了特异的细胞色素P450酶活性，能够比较真实地反映人肝细胞的代谢特征［36］，用于评价新药的肝细胞毒性。也可根据个体对同一类药物的不同反应进行个性化药物治疗［37］。Uivestad等［38］比较了来源于hESC和hiPSC的肝细胞与人原代肝细胞以及HepG2细胞色素P450酶活性及转运蛋白的表达水平，发现虽然来源于干细胞的肝细胞色素P450酶活性不及原代肝细胞，但其酶活性持续时间更长，可持续至少1周，表明hiPSC来源的肝细胞能更好地应用于长期肝毒性评价；Sirenko等［39］利用hiPSC来源的肝细胞进行高通量肝毒性评价，他们对240种不同肝毒性化合物进行高通量检测，包括细胞活性、细胞核形态、细胞完整程度以及线粒体膜电位。研究发现，利用hiPSC来源的肝细胞进行高通量肝毒性评价及机制研究是可行的；Choi等［40］利用hiPSC技术获得患者特异性肝细胞，用于药物的筛选，获得5种备选治疗药物，并利用基因定点编辑技术对患者特异性肝细胞进行突变基因的矫正。

6 hiPSC在药物发育毒性评价中的应用

胚胎干细胞实验（EST）是目前唯一获得国际认可的不需体内实验即可进行发育毒性评价的体外替代方法。因此，iPSC在发育毒性评价方面具有较大的应用前景，但同时也面临着巨大的挑战。Aikawa等［41］参照mEST方法利用受试物对hiPSC的半数抑制率（IC50PS）、人成纤维细胞的半数抑制率（IC50F）和hiPSC分化为收缩心肌细胞的半数抑制率（IC50）进行比较，若IC50F＜IC50且IC50F＜IC50PS，无胚胎毒性；若IC50F＞IC50PS（或IC50ES），或IC50F＞IC50且IC50F＜IC50PS（或IC50ES），可能有胚胎毒性；若IC50F≥IC50且IC50F≥IC50PS，有胚胎毒性；他们利用该方法对已知及未知胚胎毒性化合物进行了胚胎毒性评价。结果表明，基于hiPSC的胚胎发育毒性预测能力强于mEST。然而，由于hiPSC分化过程的复杂性及分化标准的判定，该方法还有待进一步确证。我们认为建立基于hiPSC的胚胎发育毒性评价模型的毒理学终点需要考虑以下几个方面：参考EST的毒理学检测终点；利用分子生物学等手段确立早期发育毒性检测指标、外胚层神经发育毒性检测指标、中胚层心脏发育毒性检测指标、内胚层肝发育毒性检测指标和血管发育毒性检测等，综合各方面毒性指标综合评定受试物的胚胎发育毒性。早期发育毒性评价检测指标，可以考虑检测胚胎发育早期表达的相关分子，如Oct-4，hTert和Dusp6等。神经发育毒性评价检测指标可以考虑检测神经细胞发育早期标志物神经上皮干细胞蛋白巢蛋白（nestin）、神经细胞发育晚期标志β3微管蛋白等［42］以及神经细胞动作电位的改变情况等［43］。心脏发育毒性检测指标可以考虑检测发育早期标志物Nkx2。5和GATA-4，心脏发育晚期标志物α-心肌球蛋白（alpha myosin heavy chain 6,alpha-MHC，MYH6）等，以及心肌细胞电生理改变［44］和QT间期延长等［45］。肝发育毒性检测指标可以考虑肝发育早期标志物CK19和白蛋白等，以及肝细胞色素P450活性等［46-47］。血管发育毒性检测指标可以考虑检测血管内皮细胞特异蛋白α-SMA和CD31等，以及新生血管形态学等［48］。

7 hiPSC与三维立体培养技术

hiPSC也可以作为组织培养/组织工程的种子细胞，开发出三维（3D）立体的细胞模型，用于药物的毒性评价，进一步缩小细胞水平与体内水平的差异［49］。Takayama等［50］利用3D微球培养来源于hESC及hiPSC的肝样细胞检测其肝细胞功能，各项指标均优于2D培养的肝细胞，且细胞功能活性的保持时间长于2D培养的细胞。与3D微球培养的传统肝毒性评价细胞系HepG2比较，3D微球培养的来源于hESC及hiPSC的肝样细胞更适合进行肝毒性评价。Beauchamp等［51］利用来源于hiPSC的心肌细胞进行球形3D悬浮培养，经调节心率及心肌活性的药物作用后，能够模拟人体心肌细胞对药物的反应，如心肌收缩与钙离子瞬时改变情况以及对电刺激的反应，咖啡因导致的心肌钙离子的释放及胞外钙离子水平等，表明3D培养的、来源于hiPSC的心肌细胞提供了一个具备重要心脏功能的类器官平台，为新药的研发及心脏毒性评价提供了新的模型。Takeuchi等［52］在hiPSC向胰岛细胞分化过程中，首先在2D培养条件下诱导hiPSC向内胚层分化，然后在3D培养条件下获得能够分泌胰岛素的胰岛细胞，其中30%为经葡萄糖刺激后能生成胰岛素的成熟胰岛素分泌细胞。他们的结果表明，3D培养在hiPSC向胰岛素分泌。细胞分化过程中具有重要作用。

8 结语

综上所述，目前hiPSC在药物毒性评价中的应用还处于早期的探索性研究阶段，且主要集中在心脏毒性、肝毒性和神经毒性的预测与评价。由于基于hiPSC的药物毒性评价更接近于人体细胞对药物的反应，国外的制药公司和企业对hiPSC在药物筛选中的应用都十分重视，投入了巨大财力。如法国生物公司Cellectis集团下的Cellectis干细胞部宣布推出来源于hiPSC的肝细胞产品，即hiPSHEP。hiPS-HEP具同质性、再生性及生命周期长且细胞色素P450活性稳定的特点，能够为药物发现、毒性试验与疫苗研发等一系列体外研究提供理想的平台。此外，源于hiPSC的心肌细胞和神经细胞在国外公司都有出售，如Reprocell公司和Wicell公司等。然而，尽管有多项研究表明源于hiPSC的各种体细胞可以很好地用于药物的毒性评价，但是至今为止尚未有一种基于hiPSC的药物毒性评价模型被经济合作与发展组织和美国食品和药品管理局所正式接受，其中的主要原因笔者认为是新法规制定与实施的滞后性。相信随着技术的成熟，很快就会有基于hiPSC/hESC的药物毒性评价新方法公布。目前，我国在这方面的研究与应用才刚刚起步，需要增加技术储备以应对未来的新方法。

将hiPSC应用于药物的研发、筛选、安全性评价，可以大大降低药物研发成本，减少种属差异，增加药物毒性预测的准确性。同时由于hiPSC可来源于患者自身，可以增加药物研发的针对性，实现个体化医疗。然而，将hiPSC应用于药物安全性评价也存在一些问题亟待解决：首先，利用hiPSC进行靶器官、靶细胞毒性评价时，hiPSC分化为靶细胞的效率、纯度、一致性与可重复性；其次，利用hiPSC进行发育毒性评价时，拟胚体形成时的质量控制与标准化或其他可靠毒性终点的确立；第三，国家相关部门对基于hiPSC的各种毒性评价体系的认可度及相关标准的制定。这些问题的解决需要从事hiPSC的研究者及毒理学家的共同努力，相信随着有关hiPSC的实验技术的成熟，hiPSC必将在药物的研发、筛选以及早期毒性评价中发挥越来越重要的作用。

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Application of human induced pluripotent stem cells in early drug toxicity evaluation

ZHAO Zeng-ming,HE Jun,SHU Yu-lei,ZHAO Jun,PENG Shuang-qing
(Evaluation and Research Center for Toxicology,Institute of Disease Control and Prevention,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100071,China)

Human induced pluripotent stem cells(hiPSCs),like human embryonic stem cells,can be differentiated into almost all the somatic cell typesin vitro.They are available from specific persons or diseases,and provide us with an alternative method for early drug toxicity evaluation.Cardiomyocytes derived from hiPSCs were used to evaluate drug-induced arrhythmia,electrophysiological changes and injury of cardiomyocytes.Combined with high-throughput and high-content technologies,hiPSC-derived neurons can be used to evaluate drug-induced abnormality of neuron axons,electrophysiological changes and developmental neurotoxicity testing.Plenty of hepatocytes with high CYP450 enzymes activity and more human metabolism characters can be derived from hiPSCs,so they can be used for hepatotoxicity evaluation.Furthermore,hiPSCs can be differentiated into ectoderm,mesoderm and endodermin vitro,so they can be used in embryotoxicity evaluation.In combination with 3D culture technologies,hiPSCs can also be used as seed cells of 3D culture models that can reflect the human body more exactly.

induced pluripotent stem cells;drug evaluation；drug toxicity

The project supported by National Natural Science Foundation of China（81202603）；and International Cooperation Project from Ministry of Science and Technology of China（2011DFA32190）；

PENG Shuang-qing，E-mail：pengsq＠hotmail.com，Tel：（010）66948462

R965.1

A

1000-3002-(2015)04-0614-07

10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.013

2014-07-29接受日期：2015-06-03）

（本文编辑：乔虹）

国家自然科学基金青年基金（81202603）；科技部国际合作项目（2011DFA32190）

赵增明（1979-）男，博士，助理研究员，主要从事药物毒理学研究，E-mail:zhaozm000＠163.com，Tel:（010）66948463；彭双清（1962-）男，博士，研究员，博士生导师，主要从事药物毒理学研究。

彭双清，E-mail:pengsq＠hotmail.com，Tel:（010）66948462