高胆红素血症大鼠听力损伤与耳蜗核CaM活性的相关性研究

李克方

（郑州大学第三附属医院耳鼻喉科，河南 郑州 450052）

高胆红素血症大鼠听力损伤与耳蜗核CaM活性的相关性研究

李克方

（郑州大学第三附属医院耳鼻喉科，河南 郑州 450052）

目的 研究高胆红素血症大鼠听力损伤的机制及CaM活性变化在此损伤中的作用。方法 60只新生7 d SD大鼠，随机分为对照组（C组）和实验组（M组），测试各组动物脑干听觉诱发电位（ABR），检测各组血清胆红素浓度和脑组织胆红素含量，测试各组大鼠耳蜗核CaM的免疫组化平均灰度值。结果 M组用药后ABR反应阈明显升高，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ波潜伏期明显延长；M组耳蜗核CaM免疫组化平均灰度值明显低于C组。结论 CaM活性升高在高胆红素血症听力损伤过程中发挥重要作用。

高胆红素血症；CaM；听性脑干反应；听力损伤

新生儿高胆红素血症常导致神经系统后遗症，尤其以听力损伤最常见。近年来研究表明神经细胞内Ca2+超载是神经细胞损伤重要机制。而细胞内超载的Ca2+必须与钙调素（Calmodulin，CaM）结合以后形成Ca2+-CaM复合物，才能使靶酶启动，从而引起一系列病理反应［1］，对神经细胞产生损害。为了探讨高胆红素血症时CaM在听力损伤中的作用，本课题成功制作高胆红素血症动物模型，采用免疫组织化学技术，检测耳蜗核组织CaM活性变化，研究与听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）的相关性，探讨胆红素在听觉中枢损伤中的的作用机制，为防治胆红素导致的听力损伤提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物分组：生后7 d SD大鼠60只，体质量9～20 g，雌雄不限，动物均无耳毒性药物使用及强噪声暴露史。随机分为对照组（C组），实验组（M组），每组30 只。

1.2 配制胆红素溶液： 避光环境下称取胆红素晶体20 mg溶于1 mL 0.5 mol/L NaOH中，加入双蒸水9 mL，用0.5 mol/L HCl调节pH至8.5，即配置成注射用胆红素溶液［2］，浓度为3.42 mmol/L。

1.3 制备高胆红素血症动物模型：向M组大鼠腹腔内注射胆红素溶液，注射剂量为200 μg/g体质量，给药后于恒温恒湿和避光环境中自然哺育24 h。C组大鼠以0.5 mL生理盐水代替胆红素溶液腹腔内注射，其余条件与M组相同［3］。

1.4 听性脑干反应（ABR）测试：各组动物分别测试ABR反应阈，ABR反应阈的判定以Ⅱ波为标准。

1.5 血清胆红素浓度测定：将各组动物断头取血0.5 mL，重氮反应法测定血清胆红素浓度［4］。

1.6 脑组织胆红素浓度测定：将各组动物取出脑组织后，将脑组织沿正中线切开，称重后置2 mL冰醋酸中匀浆，加同体积丙酮混匀离心（3000 r/min×10 min），抽提上清液0.2 mL加于测试管中，根据脑组织胆红素浓度标准曲线换算出脑组织胆红素浓度［5］。

1.7 耳蜗核标本制作：各组动物在进行ABR测试后，开颅并取出脑干，经石蜡包埋，经面神经根平面从前向后做连续冠状切片［6］，片厚7 μm，取从耳蜗核开始出现至消失的切片。耳蜗核的定位参照《常用实验动物脑立体定位图谱》［7］和《大白鼠中枢神经系统解剖学基础》［8］。

1.8 耳蜗核CaM免疫组化染色：免疫组织化学染色采用SABC法，经DAB显色，显微镜下观察并控制反应时间，见棕黄色阳性物质出现时用蒸馏水终止显色反应。。

1.9 图像分析：将免疫组化染色结果输入HPIAS-1000电子计算机图像系统，分析各组大鼠耳蜗核CaM免疫组化染色的平均灰度值。

1.10 统计学处理：用SPSS18.0进行统计分析，ABR反应阈和血清、脑组织胆红素含量及CaM免疫组化平均灰度值的各项数据用均数±标准差表示，两组均数比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实验动物血清和脑组织胆红素浓度：M组血清胆红素浓度（546.635±12.348）μmol/L明显高于C组（15.046±0.927）μmol/L，差异有统计学意义（P＜0.05）。C组脑组织胆红素含量为0，M组脑组织胆红素含量明显增高（6.541±0.169）nmol/g，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 ABR测试结果：M组动物用药后ABR反应阈明显升高（59± 7.18）dB SPL，与C组ABR反应阈（16±5.98）dB SPL相比差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 耳蜗核组织CaM免疫组化活性：光镜下可见耳蜗核内大多数细胞为体积比较小的圆形及类圆形细胞，少数体积较大细胞可以见到有明显突起。耳蜗核中CaM免疫组化阳性反应物为棕黄色颗粒状沉积物，主要位于耳蜗核神经细胞胞质中，神经纤维内也可见到棕黄色阳性反应物。阴性对照切片无棕黄色颗粒。M组耳蜗核CaM免疫组化平均灰度值（139.20±5.37 ）度明显低于C组（208.10±7.85 ）度，差异有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨 论

新生儿高胆红素血症若并发胆红素脑病常遗留神经系统后遗症，听力损伤尤为常见。但是目前对高胆红素血症时听力损伤的发病机制研究甚少。本实验采用出生后1周的SD大鼠腹腔内注射胆红素，制作高胆红素血症动物模型，随着血清胆红素量的增加，耳蜗核组织中胆红素沉积的量也随之增加。

听觉传导通路上的第一级中枢即为耳蜗核，是全部同侧传入听神经的终结点，与更高一级听觉中枢以及其他相关听觉核团具有密切联系［9］。大鼠耳蜗核组织HE染色切片结果显示，实验组大鼠耳蜗核中各亚核神经细胞体积明显肿胀，神经细胞数目相对明显减少，细胞核和胞质皱缩，脂褐素沉积，胞质内形成较多空泡，尼氏体相应减少。这表明胆红素沉积于耳蜗核，改变了耳蜗核的正常组织结构。

胆红素沉积于耳蜗核的神经细胞突触膜，进一步导致耳蜗核的超微结构线粒体肿胀，造成能量代谢障碍；Ca2+内流并在神经细胞内过量超载，与CaM结合后形成Ca2+-CaM复合物，发挥毒性作用，导致耳蜗核神经细胞损伤，使耳蜗核信息的传入功能受到影响，并且可造成耳蜗核对听觉信号分析和加工功能减弱，向其他核团传入的信息数量减少或质量异常，使神经细胞对听觉信号反应性降低，听觉传导时间延长，故ABRⅠ、Ⅱ、Ⅲ波潜伏期明显延长。本实验结果表明，随着脑组织胆红素含量的增加，耳蜗核CaM的免疫组化平均灰度值明显下降，耳蜗核CaM的活性增加，ABR阈值升高，各波的潜伏期延长，提示CaM活性升高在高胆红素血症所造成听力损伤过程中发挥重要作用。

［1］ Yabe D，Nakamura T，Kanazawa N，et al.Calumenin， a Ca2+-binding protein retained in the endoplasmic reticulum with a novel carboxyl-terminal sequence，HDEF［J］.J Biol Chem，1997，272（29）:18232-18239.

［2］ Rhee CK，Park HM，Jang YJ.Audiologic evaluation of neonates with severe hyperbilirubinemia using transiently evoked otoacoustic emissions and auditory brainstem responses［J］. Laryngoscope，1999，109（12）:2005-2008.

［3］ 陈舜年，贲晓明，夏振伟.胆红素脑病动物模型制作与鉴定［J］.新生儿科杂志，1997，12（4）: 166-169.

［4］ Elizebeth S.Laboratory measurment of bilirubin［J］.Clinics in Perinatology，1990，17（2）:397-416.

［5］ Wennberg RP， Johanson BB， Folbrearova J， et al.Bilirubin induced changes in brain energy metabolism after osmotic opening of the blood-brain barrier［J］.Pedatr Res，1991， 30（3）: 473-478.

［6］ 田秀芬，董明敏.豚鼠耳蜗核复合体的解剖［J］.河南医科大学学报，2000，35（6）:502-503.

［7］ 第二军医大学生理学教研室.常用实验动物脑立体定位图谱［M］.北京:科学出版社，1990:16-18.

［8］ 王平宇，朱治远，祁建，等.大白鼠中枢神经系统解剖学基础［M］.北京:人民卫生出版社，1987:9-120.

［9］ 倪道凤，杜明，梁兴群，等.不同龄豚鼠听性脑干反应和耳蜗核形态比较［J］.听力学及言语疾病杂志， 1997，5（3）:113-117.

T he Experimental Study of Changes of CaM on Cochlear Nucleus and Hearing Damage in Hyperbilirubinemia Newborn Rats

LI Ke-fang
（Department of Otolaryngology， the Third Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

Objective To investigate the effects of hearing damage with hyperbilirubinemia and function approach of neuro-toxicity. Methods Sixty newborn seven days SD（Sprague Dawley） rats were divided into contral group（C） and experiment group（M）randomly. Auditory brainstem response（ABR）and concentration of bilirubin in blood and brain in every groups were examined respectively. CaM immunohistochemistry dye were done in cochlear nucleus slices. Result ABR reflecting threshold obviously increases of group M after using medicine， Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ wave delitescence obvious extend. The average gray value of cochlear nucleus CaM in group M are obviously lower than group C. Conclusion CaM activation rising play an important role in hearing damage in hyperbilirubinemia.

Hyperbilirubinemia； CaM； Auditory brainstem response； Hearing damage

R589.9

B

1671-8194（2015）13-0006-02