强力枇杷露微生物限度检查方法的验证试验

汪正宇

安徽省宿州市食品药品检验所，安徽 宿州 234000

药物研究

强力枇杷露微生物限度检查方法的验证试验

汪正宇

安徽省宿州市食品药品检验所，安徽 宿州 234000

目的：建立强力枇杷露微生物限度检查的方法验证。方法：按2010年版 《中华人民共和国药典》，用大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、黑曲霉菌和白色念珠菌对强力枇杷露微生物限度检查法进行方法学试验验证。结果：强力枇杷露对大肠埃希菌无抑菌作用或抑菌作用较弱。结论：强力枇杷露的细菌、霉菌和酵母菌的计数方法采用常规法，控制菌检查采用常规法检验，该方法用于强力枇杷露的质量控制有效可行。

强力枇杷露；微生物限度检验法；方法验证

强力枇杷露是由枇杷叶、罂粟壳、百部、白前、桑白皮、桔梗、薄荷脑等中药制备的口服复方制剂，具有养阴敛肺，镇咳祛痰的功效［1］。2010年版 《中国药典》附录ⅫⅠC微生物限度检验方法中规定，药品的微生物限度检验方法必须进行方法验证，确证供试液制备、测定方法及检测系统适用于该药品的检验，从而保证微生物限度检验方法的科学性和检验结果的准确性。本文参照2010年版 《中国药典》［2］、《中国药品检验标准操作规范》［3］进行试验，建立强力枇杷露的微生物限度检验方法并进行方法验证，结果表明常规法适用于细菌、霉菌及酵母菌计数检查，控制菌检查采用常规法。

1 仪器与材料

1.1 试验环境 根据2010年版《中国药典》规定，试验在环境洁净度10000级，局部洁净度100级的单向流空气的无菌室进行，阳性菌操作在符合国家Ⅱ级生物安全标准的生物安全柜内进行。

1.2 实验仪器 BHC－1300ⅡA2型生物安全柜（苏州苏净仪器自控设备有限公司）；GHP－9162型电热恒温培养箱（上海金慧科电子有限公司）；MJX－160B－Z型微电脑霉菌培养箱 （上海博讯实业有限公司医疗设备厂）；DYXDHS型隔水式电热恒温培养箱 （上海跃进医疗器械厂）；YXQ－LS－75SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器（上海市博讯实业有限公司医疗设备厂）；TZQ－Ⅱ型匀质器型号 （天津市津德实验仪器技术开发中心）。

1.3 供试品 强力枇杷露（批号：20140609、20140610、20140611，安徽省雪枫药业有限公司）。

1.4 验证菌种 大肠埃希菌［Escherichia coli，CMCC（B）44 102］、枯草芽孢杆菌［Bacillus subtilis，CMCC（B）63 501］、金黄色葡萄球菌［Staphylococcus aureus，CMCC（B）26 003］、白色念珠菌［Candida albicans，CMCC（F）98 001］由中国医学菌种保藏中心提供；黑曲霉［Aspergillus niger，CMCC（F）98 003］由中国药品生物制品检定所提供。试验用菌株的传代次数为3代。

1.5 培养基 营养琼脂培养基（批号：121130）、玫瑰红钠琼培养基 （批号：110811）、营养肉汤培养基 （批号：110406）、改良马丁培养基（批号：130227）、曙红亚甲蓝琼脂培养氧基（EMB，批号：1110102）、胆盐乳糖培养基（批号：1111162）、4－甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG，批号：1110102）均由北京三药科技开发公司提供。

2 方法与结果

2.1 菌悬液的制备 黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠埃希菌置营养肉汤液体培养基中培养 （培养条件为33℃培养24小时），各取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释法稀释至10－5、10－6、10－7，备用；白色念珠菌置改良马丁液体培养基中培养 （培养条件为25℃培养24小时），取上述培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释法稀释至10－5、10－6、10－7，备用；黑曲霉置改良马丁液体培养基中培养 （培养条件为25℃培养1周），取上述培养物5ml，用0.9%无菌氯化钠溶液洗脱黑曲霉孢子，吸取孢子菌悬液 （经无菌棉花过滤）1ml，用10倍稀释法稀释至10－6，备用。

2.2 菌悬液中含菌量检验 取“2.1”中枯草芽孢杆菌10－5级稀释液1m l放入已灭菌的培养皿中，用45℃无菌营养琼脂培养基20ml注培养皿，且平行测定两皿，33℃培养48h后计数；取10－7级金黄色葡萄球菌、10－7级大肠埃希菌分别注培养皿培养，方法及培养条件同枯草芽孢杆菌。取“2.1”中白色念珠菌10－5级稀释液和10－6级黑曲霉孢子菌悬液各1ml放入已灭菌的培养皿中，用低于45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注培养皿，25℃培养5d，逐日观察计数。根据2010年版 《中国药典》规定，细菌、霉菌和酵母菌方法验证所用菌悬液含菌量应为50～100 cfu／ml；控制菌方法验证所用菌悬液含菌量为10～100 cfu／m l。结果见表1，符合要求。

2.3 供试液制备 取本品最小包装两瓶，按微生物限度检查法规定称取10g，加pH7.0的无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100mL，混匀，即为1∶10的供试品溶液。

2.4 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证 （平皿法）

2.4.1 试验组 取1∶10供试液1ml和金黄色葡萄球菌10－7级菌悬液1m l，注入同一无菌培养皿中，立即倾注低于45℃营养琼脂培养基约20m l，待凝固后置于33℃阳性细菌培养箱中倒置培养24～72h，逐日观察结果并记录。枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的验证同金黄色葡萄球菌的实验方法。取1∶10供试液1m l，白色念珠菌10－5级菌悬液1ml，注入无菌培养皿，立即倾注45℃无菌玫瑰红钠培养基20m l，待凝固后置于25℃阳性霉菌培养箱中倒置培养5d，逐日观察结果并记录。黑曲霉的验证同白色念珠菌的实验方法。

2.4.2 菌液组 取金黄色葡萄球菌10－7级、枯草芽孢杆菌10－5级和大肠埃希菌10－7级菌悬液各1ml，分别注入培养皿中，立即倾注低于45℃营养琼脂培养基，待培养基凝固后，置33℃细菌阳性培养箱中培养24～72h，逐日观察结果并记录。取白色念珠菌10－5级和黑曲霉10－6级菌悬液各1ml，分别注入平皿，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，待凝固后置25℃霉菌阳性培养箱中培养5天，逐日观察结果并记录。

2.4.3 供试品对照组 取1∶10供试液1ml，注入平皿，立即倾注低于45℃无菌营养琼脂培养基和玫瑰红钠琼脂培养基，待培养基凝固后，将营养琼脂培养基置于33℃培养24～72h，玫瑰红钠琼脂培养基置25℃培养5d，逐日观察结果并记录。

2.4.4 试验结果 由表2可知，3次平行试验大肠埃细菌、金黄色葡萄球菌和黑曲霉的试验组回收率均均大于70%，根据2010年版《中国药典》的要求可以确定常规法作为检查方法。

2.5 控制菌 （大肠埃希菌）检查方法验证 （常规法）

2.5.1 试验组 取已灭菌的装有100m l胆盐乳糖培养基的三角瓶一瓶，用无菌移液枪加入1：10供试液10m l，10－7级大肠埃希菌菌悬液10ml，放置于35℃阳性培养箱中培养24h，按大肠埃细菌的检查法检查。

2.5.2 供试品组 取1：10供试液10ml加入100ml无菌胆盐乳糖培养基中，放置于培养箱 （35℃）中培养24h，按大肠埃细菌的检查法检查。

2.5.3 阳性对照组 取规定量的大肠埃希菌加入到100ml无菌胆盐乳糖培养基中，放置于阳性培养箱 （35℃）中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.4 阴性对照组 取稀释液10ml加入100m l无菌胆盐乳糖培养基中，放置于培养箱 （35℃）中培养24h，按大肠埃希菌的检查法检查。

2.5.5 阴性菌对照组 阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌，方法同试验组。

2.5.6 实验结果 由表3可知，大肠埃希菌阳性组、试验组生长良好，说明强力枇杷露对大肠埃希菌无抑菌作用或抑菌作用较弱，可以采用常规法检查。

3 讨论

由上述验证结果可知，可以采用常规法对细菌、霉菌及酵母菌进行检查；控制菌大肠埃希菌可采用常规法检验。

由于方法验证中阳性菌会造成环境污染，所以必须严格按照2010年版 《中国药典》附录中方法验证的规定，在阳性室的生物安全柜内操作，做好防护措施。同时供试品组及阴性对照组应在符合规定的洁净室内操作。

方法验证需进行三次平行实验，为使结果获得良好的重现性，所加的培养基体积应尽量一致，培养基与所加试液应充分混合均匀。

菌落计数是方法验证实验过程中极为重要的一步，因此计数时应仔观察，必要时可借助放大镜等工具，排除药渣和小气泡的干扰，减少操作误差。

［1］南京中医药大学.中药大辞典 ［M］.上海：上海科学技术出版社，2006：833－853.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典 （一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：107－116.

［3］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规范［S］.北京：中国医药科技出版社.2010：351－369.

Research on the determination of Validation method for microbiallimits test of Strong Loquat Syrup

WANG Zhengyu
Anhui Suzhou Institute for Food and Drug Control，Suzhou 234000，China

ObjectiveTo establish microbial limit test for Compound Yangjiao Granule.MethodEscherichia coli，Bacillu Subtilis，Staphy lococcus aureus，Aspergillus niger and Candida albicans were taken as the indexes，microbial limit tese for Strong Loquat Syrup was performed according to Chinese Pharmacopoeia of 2010 version.ResultStrong Loquat Syrup had no inhibitorg effect on Escherichia coli，or the inhibitorg effectwas weak.ConclusionIt is effective and feasible that bacteria，filamentons fungi and yeast countwere detected with common method；Themethod is practicable and could be used for quality control for Strong Loquat Syrup.

Strong Loquat Syrup；microbial limits test；method validation

R284.1

A

1007－8517（2015）16－0011－02

2015.05.08）