肠道病毒71型3D蛋白研究进展

乔 乔，王志玉，温红玲

肠道病毒71型3D蛋白研究进展

乔 乔，王志玉，温红玲

目的 EV71感染可引起婴幼儿手足口病，甚至导致死亡。近年来由EV71引发的手足口病一直呈上升的流行趋势。目前中国对于手足口病的疫苗研究已进入临床试验阶段，但EV71引起的重症手足口病的发病机制仍不明确。3D蛋白主要负责病毒的复制过程，是抗病毒药物的靶点之一。本文就EV71的3D蛋白的结构功能及针对其作为靶点的抗病毒药物作一综述。

EV71；3D蛋白；抗病毒药物

肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16都可引起婴幼儿手足口病，但EV71引起的手足口病可导致严重的中枢神经系统并发症，包括无菌性脑膜炎，脑干炎，小脑炎和脑脊髓炎等，有较高的致残率和病死率[1]。1969年美国加利福尼亚首次分离出EV71后，在世界范围内呈周期性暴发或流行，主要发生在亚太地区，在中国大陆及台湾地区均有报道[2-4]，EV71感染引起的手足口病对公众健康已构成了严重威胁。我国卫生部已于2008年5月将手足口病列入丙类传染病，所以如何防治EV71等病毒引起的手足口病已成为一个严峻的问题。

1 EV71的蛋白结构和基因结构

人类肠道病毒71型属于小核糖核酸病毒科，肠道病毒属A组，无包膜，由60个原体构成的直径约30 nm的正二十面体，每个原体都由VP1，VP2，VP3和VP4 4种结构蛋白构成[5]，其中VP1，VP2，VP3在病毒外侧，VP4在病毒内侧。VP1是病毒进入细胞的关键，且包含多个抗原决定簇。病毒壳内是一条单股正链RNA，约有7 500个核苷酸。RNA上仅有1个开放阅读框架(ORF)，编码1个含有2 193个氨基酸的多聚(蛋白，该多聚蛋白可进一步水解为P1、P2、P3 3个前体蛋白，并被自身产生的2C蛋白酶和3C蛋白酶切割成11个结构蛋白和非结构蛋白，其中P1基因编码VP1、VP2、VP3、VP4 4个结构蛋白，P2、P3基因分别编码2A、2B、2C和3A、3B、3C、3D 7个非结构蛋白[5]。ORF两侧为5(和3(非编码区(UTRs)，在3(UTRs有多聚腺苷酸(polyA)尾，在5(UTRs共价结合一个小分子量蛋白VPg(3B)。

2 3Dpol的一级结构与晶体结构

在小核糖核酸病毒中，脊髓灰质炎病毒(PV)的3Dpol的晶体结构于2004年首个被解析出，肠道病毒71型的3D蛋白结构也于2010年也被解析出，分辨率为2.4。以FMDV为例，其3D蛋白晶体结构像人的右手手掌，有3个结构域，分别为“手掌”，“拇指”和“手指”，手指结构域和拇指结构域通过N-端结构域相连[5]。除此之外，在3D蛋白分子的背面有一条带正电荷的渠道，这个带正电荷的结构可利于打开与之结合的RNA的2级结构[6]，且这些带正电荷的氨基酸可与NTPs相互作用，并形成一个保守区域(motif F)。“手掌”结构域核心为3个反平行的β折叠，外围是3个α螺旋，这个结构是已知的核苷酸聚合酶结构中高度保守的[6]。所有小核糖核酸病毒的3D聚合酶的“手掌”结构域都具有催化位点。除了基序F以外，3Dpol仍有5个保守区域，分别为Motif A、B、C、D、E。其中，Motif A与B负责核苷酸的识别与结合，Motif A与C负责磷酸基团的转移，Motif C上含有体现RdRp功能特征的保守序列GDD[7]，Motif D维持手掌结构域的完整，Motif E是结合引物的区域。 “手掌”、“手指”、“拇指”3个结构域构成闭合的右手状，其中食指、环指、小指形成与单链模板RNA结合的孔道并向位于手掌结构域的活性位点延伸，而引物与拇指结构域相作用。EV71的3D聚合酶在Mn2+存在条件下有活性，在Co2+存在时几乎没有活性，在Mg2+、Ca2+、Cu2+、Ni2+、Cd2+或Zn2+存在时完全没有活性。体外转录活性研究表明，EV71 3D可以利用双核苷酸和十核苷酸 RNA 作为引物，以 poly(C)和基因组 RNA 为模板从头起始转录，DNA引物如寡聚dT15可以增强其转录活性[8]。

3 3Dpol与病毒复制

3D聚合酶是RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。RNA复制的起始过程主要分为两种：非引物依赖型(de novo)和引物依赖型[9]。非引物依赖型的起始过程至少需要以下4种物质：(1)RNA依赖的RNA聚合酶；(2)具有病毒特异性起始核苷酸的RNA模板；(3)起始三磷酸核苷；(4)NTPs。首先是在起始三磷酸核苷和NTPs之间形成磷酸二酯键。起始核苷酸为下一个核苷酸提供3′-OH。De novo的优点在于复制过程中没有遗传物质的丢失，不需要额外的酶去合成引物以及断开RNA模板链和新合成的RNA链之间的区域。大多数情况下，de novo起始过程结束后就是延伸，但有的时候de novo过程会生成无效的RNA产物或是之后作为引物的短的RNA寡核苷酸[10]。引物依赖型的起始过程需要一个寡核苷酸或者是蛋白质作为引物：(1)从mRNA的5(UTRs帽子结构切下来的寡核苷酸作为引物；(2)RdRp在RNA合成过程中中断形成的RNA小片段作为引物；(3)模板RNA的3(UTRs折返回来作为引物；(4)蛋白质作为引物是由氨基酸提供羟基。小核糖核酸病毒都是以VPg这个蛋白质作为引物开始RNA的复制过程[6]。VPg被3D聚合酶尿苷酸化是RNA复制的起始，对于VPg介导的FMDV的RNA复制起始机制研究的已经很清楚[11]。小核糖核酸的复制起始于两个UMP分子连续吸附在VPg的Try3的羟基上，然后3D通过一种滑回机制使用一个内部的染色体组的茎环结构作为模板来催化VPg成为引物。FMDV的3D和尿苷酸化以及未尿苷酸化的VPg形成的复合物都显示VPg占据在3D聚合酶中间的渠道中。Try3的羟基作为核苷酸引物的3′端自由羟基的分子类似物被放置在核苷的活性位点，从而启动了复制过程。EV71的复制过程还不甚明了，但同作为小核糖核酸病毒科，EV71与FMDV的复制起始机制相差不多。有研究发现[12]，EV71的3D聚合酶的拇指结构域上的Site-311是VPg连接的位点，且EV71的VPg尿苷酸化是一个3Dpol的双分子机制，也就是一个3Dpol分子提供VPg的Try3的羟基连接到另一个3Dpol分子的聚合酶活性位点，这种方式轮流催化了VPg→VPg-pU的转换。对Site-311进行突变可减少VPg的尿苷酸化，这对于EV71的复制是致命的，所以预测Site-311是一个潜在的抗病毒靶点。3D聚合酶上的“手掌”、“手指”和“拇指”三个结构域的保守区域都对稳定VPg起到了重要作用。Motif F带正电的核苷酸也参与尿苷酸化的过程，保证了VPg和UMP在催化反应中的正确构象。两个二价阳离子和Motif A和C的天冬氨酸残基一起催化尿苷酸化反应。RNA延伸过程是基于有序的核苷酸添加反应，这个反应是引物链3′UTRs羟基对核苷三磷酸的α磷酸基进行亲核攻击，这导致了磷酸二酯键的形成和焦磷酸(PPi)的释放。根据两个金属模型催化作用，一个金属会降低引物3′UTRs羟基的pKa值，使得其去质子化，另一个金属会正确引导三磷酸进入核酸的方向。据此得出假设，PPi是在释放之前被质子化的。有研究结合不同聚合酶模型的诱变分析和核酸动力学得出：聚合酶的活性位点上的带正电的氨基酸为PPi的质子化提供质子[13]。因此，3D聚合酶催化VPg的尿苷酸化是RNA复制的起始，且聚合酶活性位点为PPi的质子化提供质子导致PPi的释放，从而促进了RNA的延伸。

4 3Dpol作为抗病毒药物靶点

3Dpol是以RNA为复制模板的RNA聚合酶，目前还没有针对3Dpol的特异药物，但是由于3Dpol是EV71复制的关键，所以设计针对3Dpol靶点的药物对于抑制EV71的复制很重要。现在使用的对抗小核糖核酸病毒的药物多为广谱抗病毒药，如核苷类似物：Ribavirin和2(-C-methylcystidine[14-17]，还有非核苷类似物，如DTriP-22，它是一种包含哌嗪的吡唑嘧啶衍生物。有的研究表明，包含哌嗪的吡唑嘧啶衍生物对抗EV71有效，且吡唑嘧啶上包含一个苯基，哌嗪包含一个疏水的二芳基甲基对于抗病毒作用意义更大。DTriP-22与其他的衍生物相比其抗EV71活性的效果更好[19]，因此被选为抗EV71药物。DTriP-22的抗EV71活性已通过不同的病毒滴度进行评估，在RD细胞中病毒感染复数(MOI)分别为0.001、0.1和1PFU/cell时，DTriP-22都具有抑制EV71的能力。在MOI为0.001 PFU/cell和1 PFU/cell时其EC50分别为0.023和0.16 μmol·L-1[18]。DTriP-22作用于3D聚合酶的位点是R163K，比较分析肠道病毒属136株病毒，发现此区域很保守，晶体结构表明Arg-163位于“右手”结构的“环指”结构域，此结构域包含有Arg-163、Lys-167和Arg-174这几个碱性氨基酸残基，这些碱性氨基酸残基与RNA复制中即将参与的核苷三磷酸相互作用，DTriP-22通过阻止核苷酸进入3D聚合酶的空穴结构而抑制RNA链的延伸[19-20]。Huang等研究表明金黄三羧酸(ATA)通过抑制3D聚合酶的延伸活性从而抑制EV71的复制，其抑制EV71的细胞病变效应(CPE)的EC50是2.9 μmol·L-1，CC50大于211 μmol·L-1[21]。DTriP-22与ATA是抗EV71机制很明确的药物，除此之外，Chern[18]等合成了化合物pyrazolo [3,4-d]pyrimidines，具有抗EV71的作用，其EC50为0.32～65 μmol·L-1，CC50大于 25 μmol·L-1。还有研究[22]表明从植物中提取的raoulic acid也具有抗病毒作用。其EC50小于0.1 μg·mL-1。

5 小 结

EV71的3D聚合酶主要参与病毒的复制过程，其机制尚不明确，尤其是RNA与宿主细胞蛋白的相互作用仍不清楚。

抗EV71 3D聚合酶的药物已有研究，但尚未有理想的抗病毒药物。目前仍需深入研究潜在的抗病毒靶点，研制新药。其次，要将设计活性高、毒性低的抗病毒药物与对现存药物的修饰相结合研制出有效的抗EV71药物并发展有临床效果的中药。然后，将作用于病毒复制不同过程和不同靶点的药物进行复合治疗，有望得到良好效果。

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Wen Hong-ling, Email: wenhongling@sdu.edu.cn

Advances research in 3D protein of Enterovirus 71

QIAO Qiao,WANG Zhi-yu,WEN Hong-ling

(DepartmentofVirology,SchoolofPublicHealth,ShandongUniversity,Jinan250012,China)

EV71 infection can cause infant hand, foot and mouth disease, and even lead to death. In recent years, the hand, foot and mouth disease caused by EV71 has been on the rise trend. The research in vaccine of hand, foot and mouth disease has entered the stage of clinical trials at present in China, but the pathogenesis mechanism of EV71 is still not fully understood. The 3D protein that is mainly responsible for viral replication process is one of the targets of anti-viral drugs. This paper makes a review about the structure and function of the 3D protein of EV71 and aimed at it as a target of antiviral drugs.

EV71; 3D protein; anti-viral drugs

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.016

国家自然科学基金(No.81371833)；山东省医药卫生科技发展计划(No.2013WS0211)联合资助

温红玲，Email: wenhongling@sdu.edu.cn

山东大学公共卫生学院病毒学研究室，实验畸形学教育部重点实验室，济南 250012；

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 81371833) and the Medical and Health Science and Technology Development project(No. 2013WS0211)

R373

A

1002-2694(2015)08-0763-03

2014-10-09；

2015-01-21