分子分型方法在单核细胞增生性李斯特菌流行病学研究中的应用

连 凯,叶舒扬,殷月兰,焦新安

分子分型方法在单核细胞增生性李斯特菌流行病学研究中的应用

连 凯,叶舒扬,殷月兰,焦新安

单核细胞增生性李斯特菌(Lm)是一种重要的食源性人兽共患病病原菌，所引起的李斯特菌病虽然发病率低，但病死率高。传统的Lm分型方法步骤繁琐、重复性差、分辨率低。目前，多种针对Lm的分子分型方法逐渐完善，而且分辨力、分辨率、操作性和敏感性均优于传统分型方法。就目前Lm分子流行病学研究中常用的分子分型方法(PFGE分型、MLVA分型、MLST分型、MVLST分型、Lineage分型)阐述、比较，为Lm食源性疾病监测、暴发的诊断及溯源提供参考。

单核细胞增生性李斯特菌；分子分型；流行病学；李斯特菌病

李斯特菌属(Listeriaspp.)由7个种构成,包括单核细胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes，简称Lm)、伊氏李斯特(L.ivanovii)、英诺克李斯特菌(L.innocua)、韦氏李斯特菌(L.welshimei)、塞氏李斯特菌(L.seeligeri)、格氏李斯特菌(L.grayi)、莫氏李斯特菌(L.murrayi)。其中Lm和伊氏李斯特菌均有致病性，伊氏李斯特菌主要引起动物李斯特菌病，而Lm除了感染动物外，还是引起人类李斯特菌病的主要病原菌。根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原的血清学反应, 将Lm分为13个血清型，分别为1/2a、1/2b、l/2c、3a、3b、3c、4a、4b、4ab、4c、4d、4e和7型，而95%以上的李斯特菌病是由1/2a、1/2b、l/2c和4b菌株感染所致。Lm引起的李斯特菌病具有低发病率、高致死率的特点，据统计，人李斯特发病率每百万人在0.1～11.3例，死亡率为20%～30%[1]。新生儿、孕妇、老年人及免疫缺陷病人是李斯特菌感染的高危人群，易患脑膜炎、败血病、流产和多器官功能障碍等侵袭性疾病[2]。近年来，因食品污染Lm而引起的食物中毒暴发事件日渐增多，已引起许多国家卫生部门的广泛关注。

1 Lm的流行病学

Lm在自然界中分布广泛，存在于污泥、土壤、河水、青贮饲料中，可以在0-45 ℃、pH4.4～9.4、10%NaCl等环境中生长，对环境具有较强的抵抗力，也可寄生于昆虫、鱼、禽类及甲壳动物体内，感染的宿主多达40多种，反刍动物是其易感宿主。自然条件下，Lm可使牛、羊等动物发病，引起脑膜脑炎、流产和急性败血症。动物李斯特菌病主要与动物食用污染的贮存饲料有关[3]，患病动物和带菌动物是重要的传染源，通过粪、尿、乳汁、以及眼、鼻和生殖道分泌物排出细菌，对农场、屠宰场、污水、奶制品等造成污染[4]；并经动物制品如生肉、熟肉、生奶、酸奶、冰激淋等的加工和销售环节，传染给人类，导致人的李斯特菌病[5-6]。

据世界卫生组织(WHO)统计：肉制品(30%以上)、禽产品(15%以上)、奶及奶制品(5%～10%)以及水产品(4%～8%)受到Lm不同程度的污染[7]。

中国食品中污染情况比较严重。在生肉、熟肉、生奶、酸奶、冰淇淋、生食水产品等样品中都检出了Lm[6]。国外常有由Lm引起的群发性食物中毒，其中不少为动物制品污染Lm所致。如2014年丹麦暴发了多起由香肠引起的中毒事件；2011年美国暴发了严重的食物中毒事件，最终发现香瓜是污染源[8]；1999-2000年间法国279人因食用冻猪舌而感染李斯特菌，其中85人死亡[9]；1995年瑞士西部暴发了一起软质奶酪引起的中毒事件[10]。李斯特菌病呈世界性分布，对人类健康造成极大的威胁，已引起世界各国的高度重视。

2 Lm分子分型技术

由Lm引起的食物中毒事件时有报道，而有效的分型方法对于控制疾病的暴发具有至关重要的作用。传统的表型分型方法，如血清分型、噬菌体分型等，虽然操作简单、方便，却不能提供菌株间足够的相关信息，对于生化特性、血清型相同的不同菌株分辨力低。而以DNA为基础的分子分型技术，从遗传学的角度对细菌的流行病学规律进行研究，具有快速、准确、操作性强和分辨率高等优点，弥补了传统分型方法的不足，因而在食源性疾病监测、暴发的诊断及溯源等方面得到了广泛应用。

目前用于Lm的分子分型方法主要可以分为3类：(基于酶切技术的分型方法：扩增片断长度多态性(Amplified fragment length polymorphism，AFLP)、限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP)、核糖体分型(Ribotyping，RT)、脉冲场凝胶电泳(Pulsed-field gel electrophoresis，PFGE)。(基于PCR的分型方法：多位点可变数串联重复分析(Multiple-locus Variable-number Tandem-Repeats analysis，MLVA)、分子血清分型(Molecular Serotyping)、随机引物扩增多态性DNA分析(Random amplification of polymorphic DNA analysis，RAPD)。(基于测序技术的分型方法：多位点序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST)、多重毒力基因位点序列分型(Multi-Virulence-Locus Sequence Typing，MVLST)。

2.1 脉冲场凝胶电泳(Pulsed-fieldgelelectrophoresis，PFGE) PFGE以细菌染色体的结构特征为依据进行分型，不受表型的干扰，因其重复性好、分辨力强，被认为是分子分型的金标准，可用于大分子DNA的分离，其分辨力是传统琼脂糖凝胶电泳的20倍，分辨范围可达到10 Mb[11-12]。PFGE技术是利用限制性内切酶对包裹在特殊琼脂中细菌的进行消化，切割成大小不等的DNA片断，然后利用脉冲场电泳将片段分离，经染色脱色后，DNA片段在凝胶上按大小呈现特异的电泳图谱，通过软件可对菌株间图谱的异同以及细菌的同源性进行分析，从而为追踪溯源提供依据。陈伟伟[13]等用PFGE对福建省不同年份、不同地点的7株Lm分离株进行分型研究，结果显示，7株分离株分为5个型，且其中两个菌株型别一致，均来自同一厂家生产的冻鸡肉。Fugett EB[14]等采用AscI和ApaI对不用来源的Lm进行PFGE分型分析，结果显示从洛杉矶一起暴发病例中分离到的Lm菌株与瑞士分离到的Lm菌株属于同一型。2011年，美国暴发了一次最为严重的由Lm引起的食物中毒事件，Lomonaco S[8]等利用PFGE对从病人、食物和环境中分离的Lm进行分型分析，结果发现从污染香瓜中分离到的Lm与病人Lm分离株具有高度相似的带型，提示这些暴发病例可能与被Lm污染的香瓜有关。因此，采用PFGE不仅可以有效的对食品污染进行溯源，同时还可以比较不同疾病暴发菌株间的相关性。

虽然PFGE具有较强的分辨能力，但得到的结果是DNA条带而不是DNA序列，带型一样的2个菌株可能存在分子量一样但碱基序列不同的片段，因此不能提供有意义的进化分析；操作耗时、费力，并且缺乏标准化操作规程，使得电泳带型容易受到人为等多种因素的影响，同时不利于各实验室间数据的交流和比较[15-16]。

2.2 多位点可变数串联重复分析(Multiple-locus Variable-number Tandem-Repeats analysis，MLVA) MLVA是近年发展起来的以PCR为基础的新技术，其基本原理是根据被检测菌株基因组中不同位点可变串联重复序列 ( variable number of tandem repeats，VNTR) 重复单元拷贝数的差异来实现对细菌的分型，主要是利用多重PCR方法对细菌染色体上多个VNTR位点进行扩增，并结合琼脂糖凝胶电泳方法精确测定VNTR位点的重复次数，之后通过聚类软件对不同菌株VNTR位点重复次数进行聚类分析，可将菌株分为不同的基因型，从而确定不同菌株间的亲缘进化关系[17]。Murphy[18]等第一次利用MLVA对45株食源Lm分离株进行分型分析，结果显示MLVA成功的将从熏鲑鱼中分离到的Lm与其他不相关食物分离到的Lm区分开；Dass[19]等采用MLVA来追踪一冷冻熏鲑鱼加工厂中Lm的传播，共分离到124株Lm，分为8个MLVA型(Lma、Lmb、Lmc、Lmd、Lme、Lmf、Lmg和Lmi)，且成品冷冻烟熏鲑鱼中主要携带两类Lm：一类来源于原材料(Lma)，另一类来自于生产加工线(Lmc)，由此表明除了生产线外，原材料携带的Lm也可以通过生产加工线传播并最终导致成品冷冻熏鲑鱼的污染。这些对生产企业改进卫生状况以减少李斯特菌污具有重要指导意义。

与其他分子分型方法相比，MLVA具有以下优点：(实验操作简便，该方法是基于PCR扩增，并结合电泳进行分析，整个过程只需数小时，且可实现高通量分析；可提供完整的数字化实验结果，便于实验室间进行比对。且有研究发现，MLVA对于4b型菌株的分辨力明显高于PFGE、MLST、RT，其分辨力大小关系为MLVA>PFGE>MLST>RT[20]；而在另一研究中，研究者利用MLVA、PFGE同时对121株Lm临床分离株进行分型比较，结果显示PFGE的分辨力比较高[19]。但是在考虑到实验室内部进行比较的情况下，MLVA则比PFGE更为合适。虽然目前MVLA已广泛应用于多种细菌的分型研究，但其自身仍有一些不足：MLVA的引物设计首先需要全基因组序列信息，而已公布的参考菌株的全基因组序列太少，从而较难设计出高质量特异性的引物；由于采用的仪器和电泳方法不同，导致了实验结果间没有可比性；MLVA实验缺乏标准菌株的建立，无法有效简化实验的标准化控制，这也限制了MLVA技术在不同实验室中的推广应用。

2.3 多位点序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST) 1998年Maiden[21]等首次提出多位点序列分型(Multi-locus sequence analysis，MLST)，该技术针对的是看家基因上存在的变异位点，通过对等位基因片段(allele)核苷酸序列进行测定来鉴定变异，从而揭示菌株间等位基因的多样性及生物间的进化关系。由于看家基因是细菌生存、繁殖所必需的，且都具有保守性，所以在长期进化过程中改变较慢、相对稳定，因此比较适合全球流行病学研究以及不同菌株间的遗传进化关系。所选择的位点序列通常位于看家基因内部，长度约500 bp。经过MLST分析后，每个等位基因位点被命名为一个基因序号，这些等位基因位点的信息构成一个等位基因图谱(allele profile)，即序列型(sequence type，ST)[21]。Salcedo等首次建立了Lm的MLST方案，确定了用于分型的7个管家基因(abcZ、bglA、cat、dapE、dat、ldh和lhkA)，为了方便进行不同实验室间数据比较，巴斯德研究所建立了专门用于LmMLST分型的数据库(http://www.pasteur.fr/recherche/genopole/PF8/mlst/Lmono.html)。

由于等位基因之间的细微差异也会导致菌株间的ST不同，因此可通过比较每个菌株的ST型别来揭示它们之间的亲缘关系，当细菌发生变异时，等位基因上多个位点的差异与单个位点差异相比具有较远的亲缘关系。Wang[22]等对中国12个省的212株Lm进行MLST分型分析，结果显示212株菌株可分为36个ST型，其中ST9(29.1%)比较占优势，且均是血清型1/2c菌株；同时通过绘制最小生成树发现，有7个ST型(ST1-ST3、ST5、ST6、ST8、ST9)在国、内外均属于流行ST型，可引起母婴感染或疾病暴发，提示加强对这些ST型菌株的监控对于预防和控制李斯特菌病具有重要的指导意义。Knabel SJ[23]等利用MLST技术对71株Lm进行分析，将菌株分为17个ST型，绘制最小生成树，并结合血清型进行分析，结果显示共有49株菌株分布在CC8中，其中除一株菌株血清型为3a，其余菌株血清型均为1/2a。并与PFGE分型结果进行比较，认为MLST为Lm分型提供优于血清分型和PFGE的分辨力。

MLST通过分析基因的核苷酸序列，可发现比电泳图谱分析更多的等位基因，并通过构建进化树来推断不同菌株间的遗传进化关系，从而弥补了针对基因表达产物进行分型分析的技术的缺陷。此外，与PFGE等凝胶电泳方法相比，MLST是通过测定核苷酸序列进行的，操作简便快速，且数据易验证、保存和共享，是标准化的技术，很好的解决了不同实验室相互比较结果时存在的困难[24]。当然，MLST拥有诸多优点的同时，也存在一定的局限性：该方法对于血清型为4b的菌株分辨力较低；MLST的分辨力取决于看家基因的变异情况，因此基因位点的选择对于分辨力有着很大的影响，看家基因变异程度低或无变异的菌株不适合采用MLST；高额的费用和所需的特定仪器也是限制MLST推广普及的原因之一[25-27]。

2.4 多位点毒力序列分型(Multi-Virulence-Locus SequenceTyping，MVLST) MVLST是一种在MLST基础上，用进化较快的毒力和毒力相关基因代替看家基因对病原微生物进行分型分析的方法，是近年来发展较快一种新型分型技术。当需要了解Lm的地区流行状况时，若待测菌株的看家基因序列变化较小，会导致MLST的分辨能力不足，因此不适合Lm的局部流行病学研究[28]。而Lm中的一些毒力基因和毒力相关基因经常暴露于不断变化的环境中，与看家基因相比，进化较快，因此这些基因具有较高的核苷酸序列多态性，在地区流行病学研究中具有较强的分辨能力[29]。Zhang[28]等在研究中发现MLST不能有效地区分血清型l/2b和4b菌株，因此提出了MVLST分型技术，同时与PFGE、RT和MLST的进行比较，结果显示MVLST对血清型为l/2a和4b的菌株分辨力较强。Rocha[30]等对从患有脑膜炎的反刍动物中分离到的21株Lm进行MVLST分型，从而检测流行性克隆菌株，并将分型结果与人源分离株进行比对。结果显示60%的动物源分离株分布在ECI中，而ECI又与人类李斯特菌病的暴发相关，比如，1981年加拿大暴发的病例就与羊使用的饲料有关、1985年加利福尼亚暴发病例与使用的生牛奶相关，以上研究结果揭示反刍动物携带的Lm会导致人李斯特菌病的流行暴发。MVLST可以将流行不相关菌株区分开，又可以将流行相关菌株聚类在一起，Yi Chen[31]等指出MVLST在研究暴发菌株间的关系时有很好的鉴别能力，因此在地区流行病学研究中，MVLST将会是一种更简便的分型技术。

2.5 遗传谱系分型(Lineages)Lm作为一种食源性致病菌，一旦进入动物或人体体内后，可引起严重的李斯特菌病，因此，为了制定有效的监控、预防措施，需要充分的了解Lm遗传学及生态学相关信息。早在1989年，Piffaretti[32]等报道了利用MLEE分型方法对175株不同来源的Lm进行分析，通过分析16个与代谢酶相关的等位基因的变异情况，将全部菌株分为45个ETs型，之后进行聚类分析，首次发现这些菌株可以分为两个谱系(I和II)，其中谱系I包括血清型4b、1/2b和4a，谱系II包括血清型1/2a和1/2c；随后Rasmussen[33]等基于flaA(flagellin)，hly，iap(p60)，23S rDNA的部分测序数据，通过毒力基因等位分析和核糖体分型发现Lm可以分为3个谱系(I、II和III)，其中谱系III由两株血清型4a菌株构成；最近的研究中，Orsi RH[34]等对不同来源Lm的3个染色体区域进行SNP分析，包括：prfA，plcA，hly，mpl，actA，plcB，Lmo0206；Lmo0298，Lmo0299，Lmo0300；inlA，inlB。结果显示，Lm可以分为4个谱系(I，II，III和IV)，大多数Lm分离株属于谱系I和谱系II。谱系I包括血清型1/2b、3b、3c和4b 4种菌株，谱系II包括血清型1/2a、1/2c和3a 3种菌株，其中血清型1/2b、4b、1/2a与人李斯特菌病相关。大多数人李斯特菌暴发病例常与谱系I菌株相关，人临床分离株中谱系I的多于谱系II；谱系II菌株在食品中占主要优势，存在于多样环境中，通常从动物及散发人李斯特菌病病例中分离得到。与谱系I相比，谱系II含有更多的质粒，可以耐受有毒重金属和细菌素。谱系II由于inlA和prfA的突变而使毒力减弱；谱系III和IV菌株则较为稀少，主要从动物中分离得到。由此可见，通过对Lm进行谱系分型分析，不仅可以促进对Lm遗传进化方面的理解，还可以揭示不同血清型Lm在传播以及致病力方面的不同。

3 结 语

Lm作为一种重要的人兽共患病的食源性致病菌，不仅影响人们的日常生活，甚至危及生命。由于病原微生物的表型变化落后于基因变化，因此，以表型特征为基础的传统分型方法，如血清分型、噬菌体分型等，已不能满足流行病学调查的需要。而基于DNA的分子分型技术，以其快速、准确、分辨率高等优势，将必然取代传统分型方法成为Lm流行病学研究的重要工具。并且随着技术的不断标准化和规范化，在了解菌株的亲缘关系、追踪传染源、控制疫情的暴发和传播等方面，分子分型技术将日益凸显其重要作用，从而为食品安全控制带来更多便利。

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Yin Yue-lan, Email: yylan@yzu.edu.cn

Applications of molecular typing methods to the epidemiology ofListeriamonocytogenes

LIAN Kai,YE Shu-yang,YIN Yue-lan,JIAO Xin-an

(JiangsuKeyLaboratoryofZoonosis/JiangsuCo-InnovationCenterforPreventionandControlofImportantAnimalInfectiousDiseaseandZoonoses,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)

Listeriamonocytogenes(Lm) is a gram-positive, facultative intracellular bacterium which is widely distributed in the environment, and can infect more than 40 kinds of animal.Lmis described as an important foodborne pathogen that can cause zoonotic listeriosis, with the characteristics of low morbidity and high mortality. Traditional typing methods forLmare complex, poor repetitiveness and low-resolution. Currently, more and more molecular typing methods for discrimination ofLmare being established, they become more sensitive and discriminative compared with the phenotypic subtyping methods and are widely used for typingListeriaisolates. In this study, five common molecular typing methods (PFGE, MLVA, MLST, MVLST, Lineage) are introduced and compared, providing valuable reference for tracing the source of pathogenicLmcontamination and transmission routes.

Listeriamonocytogenes; molecular typing method; epidemiology; listeriosis

10.3969/cjz.j.issn.1002-2694.2015.08.015

国家自然科学基金(No.31472193)；江苏省科技支撑计划(No.BE2012367);江苏省自然科学基金(No.BK2011446)联合资助

殷月兰，Email: yylan@yzu.edu.cn

扬州大学，江苏省人兽共患病重点实验室，江苏省动物主要疫病防控协同创新中心， 扬州 225009

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31472193), the Jiangsu Key Technology R&D Program (No. BE2012367), and the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK2011446)

R378

A

1002-2694(2015)08-0757-06

2014-09-10；

2015-01-26