手足口病患儿肠道菌群结构特征的分析

吴晓康，马超锋，余鹏博，陈海龙，尹佳锋，杜毛绳，武海滨，邓慧玲

(1.西安交通大学第二附属医院检验科，陕西 西安 710004；2.西安市疾病预防控制中心，陕西 西安 710054；3.陕西省疾病预防控制中心，陕西 西安 710054；4.西安市儿童医院，陕西 西安 710003)

手足口病患儿肠道菌群结构特征的分析

吴晓康1，马超锋2，余鹏博3，陈海龙2，尹佳锋1，杜毛绳4，武海滨4，邓慧玲4

(1.西安交通大学第二附属医院检验科，陕西 西安 710004；2.西安市疾病预防控制中心，陕西 西安 710054；3.陕西省疾病预防控制中心，陕西 西安 710054；4.西安市儿童医院，陕西 西安 710003)

目的 探索手足口病患儿肠道菌群结构特征，了解肠道菌群与疾病的相关性。方法 收集手足口病住院患儿32例和健康儿童14例粪便样本，提取肠道菌群总脱氧核糖核酸(DNA)，16SrDNA-V3区聚合酶链反应(PCR)扩增，利用变性梯度凝胶电泳(DGGE)分子指纹图谱和测序技术，分析手足口病患儿肠道菌群组成结构、多样性、相似性等生态学特征。结果 手足口病患儿与健康儿童相比，DGGE指纹图谱的条带数和Shannon-Wiener指数均显著降低(t=3.92，P<0.05；t=3.24，P<0.05)，肠道菌群多样性降低；比较两组相似性系数和相似性系数累积曲线，手足口病患儿组内相似性降低(Z=-9.12，P<0.05)，菌群结构更趋不同；优势条带切胶测序结果表明，手足口病患儿以厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门为主，肠道优势菌属可能发生变化。结论 手足口病患儿肠道菌群结构、组成发生变化，疾病的发生与肠道菌群具有一定的相关性。

手足口病；肠道菌群；变性梯度凝胶电泳；多样性；相似性

手足口病(hand-foot-mouth disease，HFMD)是一种由肠道病毒引起的传染病，多发于儿童。近年来，此病容易集中流行，轻症患儿经治疗后即可痊愈，而部分患儿出现严重并发症，甚至导致死亡，已经成为威胁儿童身体健康的公共卫生问题。引起手足口病的病原主要为肠道病毒柯萨奇病毒A16型(Cox A16)和肠道病毒71型(EV71)[1]。

肠道菌群在机体代谢、免疫调节和屏障保护等起到重要作用。近来，研究发现肠道菌群结构的改变与多种疾病发生相关，如炎性肠病、肥胖、2型糖尿病、感染[2]等。有关手足口病与肠道菌群相关性的研究资料未见报道。本研究拟通过分析感染EV71病毒所致手足口病患儿肠道菌群的结构特征和组成，试图了解疾病情况下肠道菌群是否发生变化，为进一步研究疾病发生与肠道菌群相关性提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2013年在西安儿童医院住院的手足口病患儿和社区幼儿园健康儿童粪便样本，其中手足口病患儿32份，2～6岁，男20例，女12例；健康儿童14份，3～5岁，男8例，女7例。所有患儿经西安市疾病预防控制中心病毒室病原核酸检测均为EV71阳性，同时均符合卫生部公布的《手足口病诊疗指南(2010年版)》的诊断标准，采样程序符合医院伦理学要求。选样标准：①近1月内未使用抗生素、益生菌或益生元等制品；②近1月内无腹泻、痢疾、结肠炎等肠道疾病。用一次性无菌便杯收集粪便标本，密封后置冰盒中1h内运送至实验室-80°C冰箱，备用。

1.2 实验材料

1.2.1 实验仪器

本研究采用的仪器设备有：Dcode变性梯度凝胶电泳系统、Gel DocTMXR凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)、2720型聚合酶链反应(PCR)扩增仪(ABI/美国)、GeneTools图像分析软件，NanoPhotometerTM(德国IMPLEN公司)，-80°C低温冰箱(DW-40L262，三洋/日本)等。

1.2.2 主要试剂

本研究采用的主要试剂有：QIAamp Stool Mini Kit(Cat.no.51504，QIAGEN公司)、Taq酶，dNTP及缓冲液(Promega公司/美国)，丙烯酰胺(Acr)，N,N’-亚甲基双丙烯酰胺(Bis)(Promega公司)，过硫酸铵(天津市化学试剂三厂)，TEMED(sigma公司)，去离子甲酰胺，尿素(Amresco公司)，引物合成和产物测序(上海生工)。

1.3 方法

1.3.1 肠道菌群总脱氧核糖核酸提取

参照QIAamp DNA Stool Mini Kit提取粪便样品中菌群总脱氧核糖核酸(DNA)的步骤。提取产物用微量核酸检测仪NanoPhotometerTM测定DNA含量。

1.3.2 聚合酶链反应扩增

选择细菌16SrRNA-V3区通用引物参照El-Sayed等[3-4]设计的引物V3-F：5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′，V3-R：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′，在正向引物5′端添加40bp的GC夹，有利于产物在变性梯度凝胶电泳(DGGE)中的分析。50μL PCR反应体系包括：10×buffer 5μL，正向引物、反向引物(5μmol/L)各2μL，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)(10mmol/L)1μL，氯化镁(MgCl2)(2.5mmol/L)5μL，Taq DNA(5IU/μL)0.4μL，DNA模板4μL，水(H2O)30.6μL。PCR扩增程序为：采用降落聚合酶链反应(touchdown PCR)方案程序[3-4]，即预变性95°C 5min，95°C变性1min，退火温度初次设定为65°C 1min，延伸65°C 1min，最后退火温度降到55°C，在此退火温度再进行10个循环，72°C 7min，4°C保存。PCR产物用Nano Photometer TM检测仪测定含量。

1.3.3 指纹图谱分析

采用DCodeTM变性梯度凝胶电泳系统对产物分析，经预试验确定16SrDNA-V3区扩增产物最适变性梯度范围(由上到下)为40%～75%，聚丙烯凝胶浓度为10%。取10μL扩增产物与6×上样缓冲液混匀后加到上样孔中，100V电压电泳12h，温度设置为60°C。电泳完毕后，将胶放入EB溶液(0.5g/mL)中染色20min，放置成像系统下观察图像并拍照保存。利用Quantity One软件(Bio-Rad，USA)分析指纹图谱中条带数目、灰度值，分析手足口病患儿和健康儿童肠道菌群的多样性、相似性等。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 手足口病患儿组与健康儿童组肠道菌群多样性分析

DGGE指纹图谱上分离的条带清晰可见，不同样本的条带呈现不同的数量、位置和亮度特征。所检测的样本中，条带数范围2～25条，其中3～9条带较亮，图谱可直观清晰地反映肠道优势菌群，见图1。多样性分析，两组样本条带数和Shannon-Wiener指数比较，手足口病患儿组低于健康儿童组有统计学意义(t=3.92，P<0.05；t=3.24，P<0.05)。

2.2 手足口病患儿组与健康儿童组肠道菌群相似性分析

从图1中可看到，两组条带位置分布呈现不同。采用非加权组平均法(UPGMA)，计算出Dice相似性系数，健康儿童组内个体之间相似性高于手足口病患儿组内个体之间，有统计学意义(Z=-9.12，P<0.05)，见表1，提示健康个体之间菌群组成更加相似，手足口病患儿之间菌群相对更趋于不同，菌群组成结构发生变化，所检测样本的聚类分析见图2。

注：C1～C14为健康儿童组，1～32为手足口病患儿组。

图1 手足口病患儿组和健康儿童群肠道菌群DGGE图

Fig.1 DGGE profile of gut microbiota in HFMD group and healthy group

注：横坐标为聚类相似度，纵坐标为样本编号，C1～C14为健康儿童组，1～32为手足口病患儿组。

图2 健康儿童与手足口病患儿DGGE指纹图谱条带聚类分析

Fig. 2 Clustering analysis of DGGE band of gut microbiota in children with HFMD and healthy children

为了比较两组内个体之间菌群结构的相似程度，计算并绘制了两组内个体之间的成对相似系数的累积分布曲线，见图3，曲线反映的是相似性系数的分布特征，靠近Y轴的曲线表明有更多的相似性系数分布在低数值区，即更多的个体相互之间差异较大，肠道菌群结构相似性较低。图中曲线表明，小于0.5的Cs值在手足口病患儿组占到总Cs值个数的97%，而健康儿童只占到64%，这个结果表明手足口病患儿菌群结果趋于不同。

2.3 变性梯度凝胶电泳指纹图谱优势条带测序分析

选择两组DGGE图谱上优势条带切胶测序，结果发现，测序结果可以看到健康儿童组以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)为主，而手足口病患儿组以厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)为主，见表2，表明两组菌群结构发生一定的变化。

图3 两组内个体之间的成对相似系数的累积分布曲线

Fig.3 Accumulative distribution curves of dice similarity coefficient between two groups

表2 手足口病患儿组和健康儿童组DGGE条带测序结果

Table 2 Sequences results of DGGE band in HFMD group and healthy group

注：从健康儿童组切胶14条，手足口病组切胶21条，*为手足口病组位置相同条带的菌属。

3 讨论

手足口病是由肠道病毒引起的婴幼儿常见传染病。由于肠道病毒传染性强、隐性感染比例大、传播途径复杂、传播速度快，近年来本病容易出现暴发和短时间内较大范围流行。该病的发病机制目前尚不明确，有研究报道肠道病毒进入消化道后在肠黏膜内复制繁殖并持续释放到血液，然后传遍全身而发病，肠道黏膜是病毒入侵和增殖的主要场所[5-6]。人体肠道寄居着种类繁多、数量巨大的细菌群落，它与宿主处于共生互利的状态，对宿主发挥着重要的生理功能，正常的肠道菌群结构可维持和增强肠道黏膜屏障功能，还能够对抗外源性致病菌的定值和入侵，即肠道菌群的生物拮抗作用。

3.1 手足口病患儿肠道菌群多样性特征分析

本研究则通过比较手足口病患儿与健康儿童肠道菌群结构及组成差异，探讨是否因为肠道菌群结构和组成的变化，导致肠道黏膜屏障功能的降低，而促进疾病的发生。研究结果显示手足口病患儿肠道菌群与健康儿童比较存在一定的差异。

从肠道菌群的多样性上比较，患儿肠道菌群多样性降低，分析其原因可能是病毒侵袭肠道黏膜，改变其肠道生态环境，造成菌群结构发生改变，多样性降低。尹斐弘和杨娟等[6-7]发现重症手足口病患儿血浆内毒素、二胺氧化酶和D-乳酸水平等指标均高于正常儿童，认为重症手足口病存在黏膜屏障功能的损伤，同时肠道毒素等代谢产物入血造成内毒素血症。

3.2 手足口病患儿肠道菌群相似性特征分析

从两组儿童肠道菌群的相似性分析上，通过组内相似性的比较和相似性系数累积曲线可以看到，手足口病患儿组内相似性降低，肠道菌群更趋于不同，即在肠道菌群多样性降低的情况下，菌群的种类也发生改变，此结果反映出患儿肠道菌群结构发生变化。Wang等[2]研究呼吸道流感病毒感染导致肠道炎症发生的免疫学机制发现，在小鼠流感疾病发生过程中，肠道黏膜中有大量促炎症的Th17细胞聚集，当抑制Th17细胞来源的IL-17A的功能，可显著减轻肠道炎症损伤的程度；同时，小鼠肠道菌群的组成在流感疾病发生过程中也发生了改变，采用抗生素清除肠道细菌，能够显著地抑制Th17细胞的聚集并减轻肠道炎症损伤，这表明肠道菌群的改变与Th17细胞的产生之间存在联系。笔者认为是否存在相类似的机制，手足口病患儿感染肠道病毒EV71后，引起肠道菌群组成的改变，进而引起肠道及全身性炎症反应，具有重要的研究价值。

3.3 手足口病患儿肠道优势菌属分析

对指纹图谱优势条带切胶测序也发现手足口病患儿肠道优势菌属组成发生变化。健康儿童以Bacteroidetes菌门Bacteroides属为主要组成，而患儿以Firmicutes、Actino￣bacteria、Proteobacteria菌门为主要组成，两组存在明显不同。菌属组成的不同对宿主肠道黏膜屏障功能起到不同的作用。黄永坤[5]研究表明，肠道菌群中的双歧杆菌、乳酸杆菌等及代谢产物通过对肠上皮细胞的营养而产生促进增殖的作用，还可通过受体调节机制促进肠道黏蛋白的分泌，阻止病原体与肠上皮细胞的结合，对维护黏液层屏障功能的稳定有重要意义。

总之，肠道菌群和肠道黏膜屏障与疾病和健康有着密切的关系，通过全面深入的研究肠道菌群与手足口病的关系，将有利于进一步探索手足口病的发病机制，为寻找手足口病治疗新靶点提供依据。

[1]Liu C C, Chow Y H, Chong P. Prospect and challenges for the development of multivalent vaccines against hand, foot and mouth diseases[J].Vaccine,2014,32(47):6177-6182.

[2] Wang Jian, Li Feng-qi,Wei Hai-ming,etal. Respiratory influenza virus infection induces intestinal immune injury via microbiota-mediated Th17 cell-dependent inflammation[J].The Journal of Experimental Medicine,2014,211(12):2397-2410.

[3]El-Sayed W S, Ibrahim R A. Diversity and phylogenetic analysis of endosymbiotic bacteria of the date palm root borer Oryctes agamemnon (Coleoptera: Scarabaeidae)[J].BMC Microbio-logy,2015,15:88.

[4]García-Amado M A, Bozo-Hurtado L, Astor Y,etal. Denaturing gradient gel electrophoresis analyses of the vertical distribution and diversity of Vibrio spp. populations in the Cariaco Basin[J].FEMS Microbiology Ecology,2011,77(2):347-356.

[5]黄永坤.胃肠黏膜屏障功能障碍及肠道细菌或内毒素移位对机体的影响[J].临床儿科杂志,2010,28(10):908-911.

[6]尹斐弘,郑跃杰.儿童重症手足口病肠道菌群和肠道黏膜通透性的研究进展[J].中国微生态学杂志,2013,25(10):1236-1239.

[7]杨娟,黄永坤,王美芬,等.不同类型手足口病患儿肠黏膜屏障功能测定的临床意义[J].实用儿科临床杂志,2010,25(10):731-732.

[专业责任编辑：程 茜]

Construction characteristics of gut microbiota in children with hand-foot-mouth disease

WU Xiao-kang1,MA Chao-feng2, YU Peng-bo3, CHEN Hai-long2,YIN Jia-feng1, DU Mao-sheng4, WU Hai-bin4, DENG Hui-ling4

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospitalofHealthScienceCenter,Xi’anJiaotongUniversity,ShaanxiXi’an710004,China；2.CenterforDiseaseControlandPreventionofXi’an,ShaanxiXi’an710054,China；3.CenterforDiseaseControlandPreventionofShaanxi,ShaanxiXi’an710054,China；4.Xi’anChildren’sHospital,ShaanxiXi’an710003,China)

Objective To explore the characteristics of gut microbiota in children with hand-foot-mouth disease (HFMD) and investigate the correlation between gut microbiota and the disease. Methods Bacterial DNAs were extracted from the faecal samples of 32 patient children with HFMD and 14 healthy children, and PCR amplification was performed at 16SrDNA-V. Finger printing and sequencing of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) were used to analyze the composition, diversity and similarity of gut microbiota in patients with HFMD. Results Compared to healthy children, the number of DGGE bands and the Shannon-Wiener index of patients with HFMD were both significantly declined (tvalue was 3.92 and 3.24, respectively, bothP<0.05), and the diversity of gut microbiota decreased. Comparison of the similarity coefficient and the accumulative distribution curves of dice similarity coefficient of both groups indicated that the similarity in HFMD group was declining (Z=-9.12,P<0.05), and the construction of gut microbiota was different. The results of splitting predominant gel bands and sequencing also revealed that Firmicutes, Proteobacteria, Bacteroidetes were mainly represented in patients with HFMD, and that the dominant bacterial genera might change. Conclusion The composition and construction of gut microbiota in patients with HFMD have changed, which suggests that the occurrence of the disease has the correlation with gut microbiota.

hand-foot-mouth disease (HFMD); gut microbiota; denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE); diversity; similarity

2015-04-18

中央高校基本科研业务费专项资金资助项目；陕西省科学技术研究发展资助项目(2011K12-82)；西安市科学技术局医疗卫生研究资助项目(SF1208)；国家科技重大专项《病毒性传染病病原谱流行规律及变异研究》资助项目(2013ZX10004202)

吴晓康(1977-)，男，助理研究员，博士，主要从事肠道菌群与疾病相关性研究。

邓慧玲，主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2015.04.002

R378；R725.1

A

1673-5293(2015)04-0660-03