玻璃化冷冻保存法及其在运动医学关节软骨组织保存的应用

李 昊 亓建洪

玻璃化冷冻保存法及其在运动医学关节软骨组织保存的应用

李 昊 亓建洪

随着低温保存技术的持续进步, 玻璃化保存技术和方法已被广泛地用于各种生物材料的低温 保存中。玻璃化冷冻法在运动医学软组织(比如关节软骨、肌腱组织)移植方面有广阔的应用前景, 并为其相应的组织库保存提供技术保障, 在组织修复中起到重要作用。

玻璃化冷冻保存；软骨；关节；成活率

随着低温保存技术的持续进步, 学者们发现在深低温环境中的离体生物材料会逐渐减缓其新陈代谢的速度, 严重的停止新陈代谢, 因此能够得以长期保存。低温储存技术包括快速降温法、连续慢速降温法、梯度降温法、程序性降温法、玻璃化冻存技术等。玻璃化冷冻保存法自被人们发明至今一直都是在此领域内的专家所研究的焦点话题［1］。

1 玻璃化冷冻保存法

生物材料(细胞、组织、器官) 脱离供体后实现长时间的保存很难。伴随着低温保存技术的不断发展, 学者们发现在深低温环境中的离体生物材料会逐渐减缓其新陈代谢, 严重的停止新陈代谢, 因此能够使其得以长期保存。玻璃化冷冻保存法自被人发明至今一直都是低温保存领域内的专家所研究的焦点话题。由于科技进步, 随着研究技术的不断发展和应用领域的不断扩展, 玻璃化保存技术和方法已广泛地用于各种生物材料的低温保存中。

玻璃化冷冻保存技术里面所述的“玻璃化”是着眼于物理层面所定义的, 即在短时间内降低液体的温度, 使其变成玻璃体(非晶体固态)。影响玻璃化保存的主要因素包括冷冻保护剂(cryoprotective agents, CPAs)的种类及浓度、降温速率、升温速率和储存温度等。要实现玻璃化的关键是需要极快的降温速率和较高浓度的CPAs 。当前一共有50多种冷冻保护剂是运用比较广泛的, 一共有3个类别。CPAs 的的挑选是非常关键的, 运用在玻璃化冷冻保存的CPAs浓度要比另外一些诸如程序性降温的冻存工艺浓度更高。研究得知［2］, CPAs溶液的浓度与在相同时间范围内低温保护剂所渗进软骨内部的剂量呈现正向关联, 但CPAs的浓度越高, 意味着对软骨会造成越大的损伤, 毒性非常大。科学分配CPAs, 让它不仅仅发挥其玻璃化与穿透性作用,而且还可以减轻冷冻保护剂对细胞可能造成的伤害。玻璃化冷冻保存技术为组织器官的长期保存提供更为广阔的前景, 玻璃化冷存工艺能够使得原本生物细胞活性、完整性得以维持, 抗原性得以缩减。如今, 美国红十字会已经对CPAs的成分表示了认可, 允许运用其来保存人体组织器官［3］, 到现在, 在人精子、红细胞单核细胞、胰岛等的保存中得以广泛的运用［4］。

2 玻璃化冷冻保存法在运动医学骨关节组织保存的应用

2.1 关节软骨组织的玻璃化冷冻保存 运动医学领域非常普遍的病变就包括了软骨损伤与缺损, 缺损后软骨不具有较好的自身修复与重建能力, 假若治疗不及时, 会使得软骨出现严重的退变［5］。关节软骨包括了诸多细胞外基质(占据比重为98%～99%)与少部分的软骨细胞, 细胞外基质的成分包括水、胶原与蛋白多糖、糖蛋白与一些其他类别的蛋白。关节软骨含有丰富的水分, 占据了65%～80%的湿重比。关节软骨不具有神经支配与血液、淋巴供应, 相对来说它的细胞密度与活性都非常低, 所以软骨一直往往不会导致剧烈的免疫反应［6］。因此, 软骨病变最长运用的修复手段就是关节软骨移植。相关研究得知, 假若并未对软骨实施低温处理, 常温状态下软骨只可以保存2 h, 软骨在3 h之后其排列出现紊乱, 形成了非常多的裂隙［7］；鲜活的软骨移植物没有广泛的来源, 会出现免疫排斥、移植软骨易被吸收［8］。因此如今很多的专家都将注意力集中在冷冻软骨移植技术, 期望妥善处理鲜活异体软骨移植导致的各种问题。

相关研究表明［9］：通过玻璃化冷冻保存液对软骨组织实施预处理保存之后, 软骨组织活性得以提升, 在8周的时间内, 其存活率高达74.5%, 此外细胞基质成分有着优越的代谢活性, 此方法的成效非常理想。相对于缓速梯度降温这一方法, 玻璃化法能够将冷冻保存后软骨细胞存活率得以明显增强, 软骨基质内蛋白多糖稳定性得以保持, 基质受到的损伤降低。通过玻璃化法对关节软骨进行体外冷冻保存能够获得较为理想的效果, 但其移植效果还要展开更深入地研究。

2.2 肌腱组织的玻璃化保存 肌腱采用玻璃化冷冻保存,其细胞活性得到较好的维持, 对于肌腱细胞外基质和胶原结构的损伤非常小, 所以在移植处理之后的肌腱细胞有着较好的生物活性, 其修复成效和鲜活的自体肌腱无异, 但相对于自体组织来说, 修复重建所耗费的时间较多［10］。

肌腱是一种低免疫的原性组织, 肌腱细胞承担其免疫抗原性的表达［11］。Kagabu等［12］在分析研究了卵巢玻璃化保存后, 得知组织免疫原性会在此过程中显著下降, 可能的原理为：①低温保存对异体抗原呈递细胞产生了抑制。②细胞膜组织主要的相容性抗原会被浓度较高的玻璃化溶液浸透和渗透性脱水所改变, 因此供体的免疫原性被缩减。

1992年, 异体肌腱移植开始在临床运用［13-15］。相关研究得知, 玻璃化保存肌腱能够使得肌腱组织抗原性得以下降,肌腱生物活性得以保存, 相对于另外一些处理方法, 移植后的痊愈速度更快, 获得世界众多专家学者的赞许［16］。

3 小结与展望

玻璃化法冷冻保存细胞(精子［17］、卵母细胞［18］等)在临床上已获得普遍的运用, 逐渐完善了对皮肤［19］、神经［20］、角膜［21］、心脏瓣膜［22］、血管［23］、肾脏［24］、卵巢等组织的玻璃化法保存技术［25］。同样, 玻璃化冷冻法在运动医学软组织移植方面有广阔的应用前景。目前, 随着技术的发展, 自身组织工程软骨修复技术虽已成功研发, 但是临床使用较少,费用也较昂贵, 无法得到普及发展。性价比相对较高的异体组织移植技术因此得到不断发展, 同种异体软骨、肌腱组织来源相对较广, 移植技术已相对成熟, 玻璃化保存技术的发展可为其相应的组织库保存提供技术保障, 在组织修复中起到重要作用。关节软骨的玻璃化保存方法非常便捷、高效,由于冷冻工艺与冷冻剂获得了进一步发展, 有效提升了其冷冻保存效果, 发展前景非常广阔［26］。

［1］ Rall WF, Fahy GM.Ice-free cryopreservation of mouse embryos at -196℃ by vitrification.Nature, 1985, 313(6003):573-575.

［2］ 平安松, 刘世清.冷冻保存对软骨细胞活性及超微结构的影响.中华实验外科杂志, 2004, 9(21):1114-1115.

［3］ Brockbank KG, Chen ZZ, Song YC.Vitrification of porcine articular cartilage.Cryobiology, 2010, 60(2):217-221.

［4］ 许海峰, 刘宝林, 高志新.细胞及组织的玻璃化保存研究.低温工程进展, 2010(5):59-63.

［5］ Moskowitz RW.Osteoarthritis：Diagnosis and Medical/Surgical Management.4th ed.Philadelphia： Lippincott Williams & Wilkins, 2007:71-107.

［6］ Darling EM, Athanasiou KA.Biomechanical strategies for articular cartilage regeneration.Ann Biomed Eng, 2003, 31(9):1114-1124.

［7］ 王泓, 马信龙, 张园.新鲜人关节软骨试件在体外不同环境下退变的组织学观察.中国组织工程研究与临床康复, 2010, 14(15):2701-2704.

［8］ 王丽霞, 李敏, 张瑞存, 等.不同保存方法对同种异体软骨移植修复软骨缺损的免疫原性影响.中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(53):10035-10038.

［9］ 宋洪强, 玄燕华, 吴雅迪, 等.玻璃化冷冻法保存关节软骨.中国组织工程研究, 2012, 16(46): 8615-8619.

［10］ 胡成栋, 刘曦, 张伯勋, 等.玻璃化法保存同种异体肌腱移植材料的可行性.中国组织工程研究与临床康复, 2011, 15(12):2175-2178.

［11］ Guidos C, Sinha AA, Lee KC.Functional differences and complementation between dendritic cells and macrophages in T-cell activation.Immunology, 1987, 61(3): 269-276.

［12］ Kagabu S, Umezu M.Transplantation of cryopreserved mouse, Chinese hamster, rabbit, Japanese monkey and rat ovaries into rat recipients.Exp Anim, 2000, 49(1):17-21.

［13］ 李丽, 周琳瑛, 张发惠, 等.SD 大鼠肌腱冷冻维持温度选择的实验研究.中国临床解剖学杂志, 2004, 22(1):84-86.

［14］ Iancu CV, Tivol WF, Schooler JB, et al.Elect ron cryotomography sample preparat ion using the Vit robot .Nat Protoc, 2006, 1 (6) :2813-2819.

［15］ Fahy GM, Wowk B, Wu J, et al.Cryopreservation of organs by vit rification: perspectives and recent advances.Cryobiology, 2004, 48 (2) : 157-178.

［16］ Dahl SL, Chen Z, Solan AK, et al.Feasibility of vitrification as a storage method for tissue-engineered blood vessels.Tissue Eng, 2006, 12 (2) : 291-300.

［17］ Dong Q, Correa LM, VandeVoort CA.Rhesus monkey sperm cryopreservation with TEST-yolk extender in the absence of permeable cryoprotectant.Cryobiology, 2009, 58(1):20-27.

［18］ Sripunya N, Somfai T, Inaba Y, et al.A comparison of cryotop and solid surface vitrification methods for the cryopreservation of in vitro matured bovine oocytes.J Reprod Dev, 2010, 56(1):176-181.

［19］ 朱兆明, 贾晓明, 柴家科, 等.玻璃化法储存皮肤的实验研究及临床应用.中华外科杂志, 1991, 29(11):705-707.

［20］ Decherchi P, Lammari-Barreault N, Cochard P, et al.CNS axonal regeneration with peripheral nerve grafts cryopreserved by vitrification: cytological and functional aspects.Cryobiology, 1997, 34(3):214-239.

［21］ Fan WX, Ma XH, Ge D, et al.Cryoprotectants for the vitrification ofcorneal endothelial cells.Cryobiology, 2009, 58(1):28-36.

［22］ Schenke-Layland K, Madershahian N, Riemann I, et al.Impact of cryopreservation on extracellular matrix structures of heart valve leaflets.Ann Thorac Surg, 2006, 81(3):918-926.

［23］ Baicu S, Taylor MJ, Chen Z, et al.Cryopreservation of carotid artery segments via vitrification subject to marginal thermal conditions: correlation of freezing visualization with functionalrecovery.Cryobiology, 2008, 57(1):1-8.

［24］ Fahy GM, Wowk B, Pagotan R, et al.Physical and biological aspects of renal vitrification.Organogenesis, 2009, 5(3):167-175.

［25］ Isachenko V, Lapidus I, Isachenko E, et al.Human ovarian tissue vitrification versus conventional freezing: morphological, endocrinological, and molecular biological evaluation.Reproduction, 2009, 138(2):319-327.

［26］ 王文良, 刘英杰, 张华亮, 等.玻璃化保存对兔肌腱组织形态学观察.武警医学院学报, 2009, 18(3):204-207.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2015.12.181

2015-03-23］

山东省自然科学基金资助项目(项目编号：ZR2013HM034)

271000 泰山医学院运动医学研究所

亓建洪