A型流感病毒致病分子机制及禽流感诊断

沙德军（四川省盐边县红果彝族乡畜牧兽医站 617100）

焦万洪（四川省盐边县农牧局畜牧站 617100）

李莉（四川省盐边县桐子林镇畜牧兽医站 617100）

A型流感病毒致病分子机制及禽流感诊断

沙德军（四川省盐边县红果彝族乡畜牧兽医站 617100）

焦万洪（四川省盐边县农牧局畜牧站 617100）

李莉（四川省盐边县桐子林镇畜牧兽医站 617100）

禽流行性感冒是由A型流感病毒引起的从呼吸系统病变到全身败血症的一种高度急性传染病，对养禽业造成了巨大的损失。

1 禽流感病毒感染和致病的分子机制

1.1 吸附、穿膜和脱壳

病毒粒子血凝素突起识别和结合宿主细胞表面含唾液酸的特异性受体，使病毒与宿主细胞接触并吸附到细胞膜上，然后被吞入，形成胞饮泡，胞饮泡与溶酶体融合使胞内pH降到5，病毒粒子血凝素蛋白构型改变使位于轻链HA2N端的融合序列暴露，引起病毒囊膜与细胞膜融合，使病毒粒子内部的核衣壳释放到胞浆内。

1.2 基因组的转录与复制

病毒脱去囊膜后其核酸片段进入宿主细胞核。首先，病毒RNA聚合酶结合到宿主mRNA的5′端，通过聚合酶组分2的核酸内切酶活性切下11个核苷酸，这一序列带有帽状结构，可直接作为引物。引物加上后，聚合酶组分1以病毒RNA为模板催化合成起始，并使链延伸。接上去的第一个核苷酸是G，它与病毒RNA聚合酶的3′端第二个核苷酸互补，病毒转录酶不转录3′端的第一个核苷酸（U）。当链延伸到14个核苷酸长度时，引物被释放下来，但3′端的A仍保留在mRNA上，病毒mRNA的5′端仍为AGC。当链延伸到近5′端的poly（U）时，以此为模板合成poly（A）尾后终止链的延伸。因此，病毒mRNA是病毒RNA的不完全转录物。6个单顺反子mRNA在核内合成后，很快转移到细胞浆翻译病毒蛋白。

1.3 病毒蛋白的合成

mRNA在核内合成后转移到细胞浆，在核糖体上翻译成为病毒血凝素、神经氨酸酶、核蛋白、聚合酶组分1、聚合酶组分2和聚合酶组分PA。NS和M基因的mRNA分别进行剪接，各产生两个mRNA，翻译成非结构蛋白NS1、NS2，和基质蛋白M1、M2。血凝素HA和神经氨酸酶NA在粗面内质网内进行糖基化，在高尔基体中修饰后运输到细胞膜。

1.4 病毒粒子的装配

首先，HA和NA插入到细胞膜，然后M1移向细胞浆膜的内侧面，非连续地贴补使之增厚。NP在细胞浆合成后首先以游离状态存在，但很快进入细胞核并与新合成的vRNA结合形成核衣壳。8个基因节段和内部病毒蛋白（NP、PB1、PB2、PA、M2）一起组装，并移送到有HA、NA和M2插入的细胞膜位置，准备出芽。

1.5 病毒的出芽和释放

这个过程可持续数小时而不溶解感染的细胞，目前机制尚不清楚。M1合成后到达细胞膜并与HA、NA或M2的胞浆区之间相互作用可能是出芽的信号。NA去除病毒囊膜上的唾液酸，避免子代病毒在细胞膜上的吸附聚集，从而促进病毒粒子的释放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶将HA裂解为HA1和HA2，使病毒粒子具有感染性并进入新一轮的复制，这个裂解过程可能在胞外完成。

2 禽流感的诊断

因为禽流感亚型众多，毒力差别很大，临床症状也千差万别，高致病性禽流感除了具有大流行的特点外，很难与其它传染病区分，因此单靠临床诊断常常难以定性。AIV的确切诊断有赖于病毒的分离和鉴定。

2.1 病毒的分离

病毒通常在消化道内复制，所以一般从活禽或死禽的气管和泄殖腔中分离病毒。消化道和呼吸道的组织、分泌物、排泄物也都适合于分离病毒。在高致病性AIV造成全身感染的条件下，由于严重的病毒血症，实际上每一器官都能分离到病毒。

临床上分离病毒的方法常用棉拭子取气管和泄殖腔内的分泌物，再将棉拭子放在含有抗生素的平衡盐溶液中，以抑制细菌生长。鸡胚接种是目前分离病毒的常用方法。也可收集器官并放在灭菌的小瓶中，在对器官进行取样时，应尽量把不同脏器的样品分别收集，因为从内脏器官分离到流感病毒通常意味着全身感染，这常与致病性高致病性禽流感有关。

2.2 病毒的鉴定

用鸡红细胞检测鸡胚尿囊液的血凝活性是鉴定禽流感的方法之一，有常量和微量两种技术。

HA表面抗原亚型的鉴定可在血凝抑制试验（HI）中用一组目前已知的16种（H1～H16）不同血凝素的抗血清来鉴定HA的亚型。抗HA血清最好用纯化的HA蛋白制备，或用单克隆抗体，这样可以避免由于抗NA抗体所产生的空间干扰。但是，用已知亚型的抗HA抗体不能检测含有新的HA亚型的流感病毒。血凝阳性的病毒尿囊液还应当与新城疫病毒感染所引起的血凝活性区别。

NA亚型通常用制备的9种已知神经氨酸酶的抗血清做神经氨酸酶抑制试验（NI）来鉴定。现已经研制出微量NI技术，这有助于对大量分离物的分析，并且易于操作。

对于AIV的毒力鉴定，OIE认为，用1：10倍稀释具有感染性的鸡胚尿囊液，静脉注射8羽4～8周龄的易感鸡，每羽0.2ml，若10d内致死6～8羽，则这样的流感病毒为高致病性AIV。

2.3 血清学诊断方法

用血清学方法检测感染鸡抗体的存在，一般在病毒感染7～10d后就可以检测到抗体。常用的检测抗体的技术包括HI试验、琼脂双扩散试验（AGIP）、病毒中和试验、神经氨酸酶抑制试验（NI）、单辐射溶血试验（SRD）、放射免疫试验（RIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）。