无症状性脑动脉粥样硬化与大动脉粥样硬化性卒中患者血浆微小RNA表达分析

杨淑娜，马爱军，潘旭东，仲倩维，王兰，张璋，庞萌

微小核糖核苷酸（microribonucleic acid，miRNA）是一类长20～24 nt的内源性非编码核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）分子，主要通过识别靶基因3’非翻译区的靶位点介导mRNA降解或者翻译抑制发挥作用[1]。已有研究提示miRNAs在血管内皮细胞炎性反应和衰老[2]、血管平滑肌细胞增殖和迁移[3]、单核细胞黏附及其向巨噬细胞分化[4]、血管完整性维持[5]及胆固醇代谢[6]等过程中发挥调控作用，并且在脑缺血后神经元凋亡及缺血性卒中病理生理过程中起到重要调控作用[7-9]。目前认为大动脉粥样硬化（large artery atherosclerotic，LAA）性卒中比较明确地由无症状性脑动脉粥样硬化（asymptomatic cerebral atherosclerosis，AS）所致[10]，但在AS的发生发展过程和LAA性卒中形成过程中，miRNA的变化尚不完全明确。研究证实，miRNA能够在血浆中稳定存在[11]，本研究采用Solexa高通量测序技术建立AS患者及LAA性卒中患者血浆miRNA差异表达谱，并对差异miRNA调控的靶基因进行初步预测和功能分析，为进一步研究AS和LAA性卒中的发生发展机制提供新线索。

2 对象和方法

2.1 研究对象 连续选入2013年1月～2013年2月于青岛大学医学院附属医院神经内科就诊的首次发病72 h内的缺血性卒中患者或健康体检者，所有参与者均为长期生活在本地区的汉族人，并签署知情同意书。该研究经过医院伦理委员会批准。

2.1.1 LAA组患者 按照急性卒中治疗低分子肝素试验病因分型法（Trial of Org 10172 in Acute Stroke Treatment，TOAST分型）[12]属于LAA性卒中患者8例。

入组标准：首次发病且72 h内就诊的LAA性卒中患者，年龄50～80岁。

排除标准：心源性栓塞、其他病因或不明原因型卒中，心脏疾病及近期发生的急性心肌梗死、心绞痛，严重的肝、肾功能不全，严重感染、肿瘤、血栓性疾病，以及发病前2周内服用抗凝、抗血小板药物者。

2.1.2 AS组患者 本研究纳入AS脑血管动脉粥样硬化狭窄程度≥50%的受试者8例。

入组标准：既往无脑血管病发作史，颅脑电子计算机体层扫描（computerized tomograthy，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）证实无脑梗死灶；影像学检查显示脑血管存在动脉粥样硬化斑块且导致血管中、重度狭窄（狭窄率≥50%），年龄50～80岁。

排除标准：近2周内服用抗凝剂、抗血小板药物者，其余同LAA组。

2.1.3 对照组 本研究纳入同期体检的健康对照且脑血管未见明显狭窄或动脉粥样硬化斑块者8例。

入组标准：既往无脑血管病发作史，颅脑CT或MRI证实无脑梗死灶；影像学检查显示脑血管未见明显狭窄或动脉粥样硬化斑块；年龄50～80岁。

排除标准：近2周内服用抗凝剂、抗血小板药物者，其余同LAA组。

2.2 标本收集 所有受试者均于入院后次日凌晨5点空腹抽取前臂静脉血5 ml置于乙二胺四乙酸二钠（edetate disodium，EDTA）抗凝管，室温固定2 h，常温下3000 r/min离心10 min，收集上清液置于Eppendof管中，－80℃冻存待测。

2.3 研究方法方法

2.3.1 收集资料 收集所有研究对象的基本人口学信息、高血压、糖尿病、吸烟史、饮酒史等资料，所有研究对象均经颅脑CT和（或）MRI证实有无缺血性卒中，并行经颅多普勒（transcranial Doppler，TCD）、心脏超声、颅脑磁共振血管成像（magnetic resonance angiography，MRA）、颈部CT血管造影（computed tomograthy angiography，CTA）和（或）数字减影血管造影（digital subtraction angiography，DSA）等检查明确脑血管病变情况。缺血性卒中患者诊断符合中国急性缺血性卒中诊治指南2010中的诊断标准[13]；TOAST分型中的LAA性卒中。采用北美症状性颈动脉内膜切除试验（North American Symptomatic Carotid Endarterectomy Trial，NASCET）法计算血管狭窄率[14]，血管狭窄率=（狭窄远端正常直径－狭窄段最窄直径）/狭窄远端正常直径×100%。

2.3.2 RNA提取及高通量测序 用mirVana PARIS试剂盒提取总RNA，采用Ambion’s miRNA分离试剂盒（美国Ambion公司）分离富集miRNAs，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。然后在RNA的5’和3’端加上接头后，进行逆转录和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR），最终得到的PCR纯化产物用于高通量测序（深圳华大基因）。通过与miRNA数据库（miRBase）中指定范围的miRNA进行比对，鉴定样品中的已知miRNAs。

2.3.3 数据处理及分析 将测序量进行归一化处理后进行miRNAs的聚类分析和筛选。归一化表达量=miRNA表达量/样品总miRNA表达量×归一量级；采用MeV 4.6软件进行miRNAs的聚类分析；Fold-change法筛选差异表达的miRNAs：差异表达的miRNA定义为P≤0.05且表达量差异倍数＞2或＜0.5。

2.3.4 预测差异miRNAs的靶基因并进行功能分析 利用Miranda、Pictar、Targetscan软件预测差异miRNAs的靶基因，取至少2个软件预测到的基因为靶基因，并将这些靶基因投射到Gene Ontology数据进行GO分析（分别描述基因的分子功能、所处的细胞位置、参与的生物过程）。以校正后P＜0.01为显著性阈值。

2.3.5 实时荧光定量PCR验证 根据高通量测序结果，选取归一化表达量较高的miRNAs（miR-146b-5p、miR-23a-3p、miR-10b-5p）进行实时荧光定量PCR验证，采用SYBR PrimeScript miRNA RT-PCR试剂盒（TAKARA公司）进行miRNAs Poly（A）加尾反应、逆转录和PCR。miRNA的特异性上游引物购买于TAKARA公司。Poly（A）加尾反应和逆转录反应条件为37℃ 60 min，85℃5 s，产物－20℃保存。实时定量PCR条件为，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40个循环。反应体系均为20 μl，按照说明书配制反应液，具体操作步骤严格按照说明书进行。PCR仪和结果分析软件分别为RotorGENE-3000、RotorGene6（美国Corbett Research公司）。选用U6snRNA作为内参，采用2-△△Ct法计算血浆中miRNA的相对表达量。

2.5 统计分析 采用SPSS 17.0统计软件，计量资料用（s）表示；计数资料用百分数（%）表示。多样本均数比较采用单因素方差分析，差异有显著性时采用LSD检验进行两两比较。率的比较采用χ2检验。

3 实验结果

3.1 高通量测序入组者一般临床资料比较 3组样本参与者的年龄、高血压病史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史水平差异无显著性（表1）。

3.2 已知miRNA聚类分析结果 将高通量测序得到的miRNA标准值进行聚类分析，关系近的miRNA会聚到一起（图1），由于全图较长，所以只能截取部分呈现，红色表示上调，绿色表示下调，黑色表示差异无显著性。

3.3 3组比较差异表达的miRNAs AS组与LAA组表达差异无显著性（P＞0.05或/且0.05＜表达量差异倍数＜2），并较对照组差异表达的miRNAs（P≤0.05且表达量差异倍数＞2或＜0.05）有41个（表2），血浆中的含量是control组高于LAA组和AS组。3组两两比较均有差异的miRNAs（P≤0.05且表达量差异倍数＞2或＜0.05）有26个（表2），在血浆中的含量是对照组高于LAA组，LAA组高于AS组。

3.4 差异表达的miRNA靶基因预测及功能分析结果

表1 高通量测序入组者一般临床资料比较

图1 已知miRNA的聚类分析图（部分）注：miRNA：微小核糖核苷

表2 3组比较差异表达的miRNAs

3.4.1 靶基因预测结果 3个靶基因预测软件，取至少2个软件预测到的基因为靶基因，得到的靶基因很多，表2中只列出部分预测到的靶基因。

3.4.2 靶基因功能分析 LAA组和AS组表达一致，且较对照组差异表达的miRNA的靶基因生物学过程主要富集在转运、定位、神经系统发育、细胞黏附和生物调控。3组表达均有差异的miRNA的靶基因生物学过程主要富集在生物调节、机体发育、代谢过程的调节和细胞分化（图2）。

3.5 实时荧光定量PCR验证结果 采用实时荧光定量PCR对miR-146b-5p、miR-23a-3p、miR-10b-5p进行验证。3种miRNAs的PCR扩增峰均在35个循环之内，溶解曲线显示单峰，提示扩增产物特异性良好。检测结果显示，miR-146b-5p和miR-23a-3p在3组间表达均有差异（P＜0.05），相对表达量为对照组高于LAA组，LAA组高于AS组；miR-10b-5p在AS组和LAA组表达差异无显著性（P＞0.05），但较对照组表达下降（P＜0.05）（图3），结果与Solexa高通量测序结果一致。

4 讨论

Solexa高通量测序技术是近年来发展的新测序技术，具有所需样品量少、高通量和高精确性等优点，正逐渐代替传统的Northern blot、阵列平台检测技术、荧光定量PCR技术和第一代基因芯片技术等成为miRNAs检测的有效手段[15-16]。本研究采用该技术检测血浆miRNAs的差异表达谱。

已有文献报道miRNAs在AS和LAA性卒中的发生、发展过程中发挥着关键作用。Hergenreider等[17]研究发现，内皮细胞释放含有miR-143的微泡，平滑肌细胞将这种微泡吸收，引起平滑肌细胞表型改变，进一步在动物实验中证明对患有AS的小鼠注射miR-143微泡，能减少小鼠体内动脉粥样硬化病变的形成。Cheng等[18]通过细胞实验研究证明，miR-143作用于Krupppel样因子（Krupppel like factor，KLF）2、心肌蛋白等转录因子，促进血管平滑肌细胞的分化和抑制增殖。本研究检测人血浆中miRNA，发现miR-143在AS和LAA性卒中患者表达水平与健康对照者不同。已有研究证实[19]，血管细胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）是miR-126的一个靶基因，可介导白细胞与内皮细胞的黏附，在人和小鼠中，miR-126低表达会上调VCAM-1表达而增强巨噬细胞黏附于血管内皮的能力。Long等[20]检测miR-126在健康人和LAA性卒中患者血浆中的表达水平，结果显示miR-126在LAA性卒中患者血浆中表达量低于健康人，提出miR-126可作为LAA性卒中的血浆标志物。而本研究同时检测健康人、AS患者和LAA性卒中患者血浆中miR-126的表达水平，结果显示miR-126在AS患者与LAA性卒中患者血浆中的表达水平差异无显著性，提示血浆miR-126表达水平的下降主要与AS有关，而非梗死后脑组织损伤所致，因此，推测miR-126有可能是脑动脉粥样硬化的潜在血浆标志物，这有待于大样本实验进一步的探究。

表3 靶基因预测的部分结果

图2 差异miRNAs靶基因参与的生物学过程注：A：LAA组和AS组表达一致，且较对照组差异表达的miRNAs的靶基因生物学过程（P＜0.01）；B：3组表达均有差异的miRNAs的靶基因的生物学过程（P＜0.01）。miRNA:微小核糖核酸；LAA：大动脉粥样硬化性卒中；AS：无症状性脑动脉粥样硬化

图3 选择的3种miRNAs相对表达水平注：*：P＜0.05。MiRNA：微小核糖核酸；LAA：大动脉粥样硬化性卒中；AS：无症状性脑动脉粥样硬化

本研究结果显示3组表达均有差异的miRNAs，在血浆中的含量是对照组高于LAA组，LAA组高于AS组。研究显示，卒中发生后，神经细胞及血管壁细胞坏死，胞质内miRNAs释放入血，导致卒中后血浆miRNAs水平较卒中前有所升高[21]；缺血急性期氧化应激、炎症和凋亡反应也会导致miRNA水平较卒中前有所升高[22-23]，这可能是miRNAs在LAA组含量高于AS组的可能原因。而LAA组与AS组含量都低于对照组，我们考虑是与AS的发生发展过程有关，其中的发生发展机制有待于进一步基础实验研究。

本研究通过生物学软件对差异性表达的miRNAs进行靶基因预测和功能分析。靶基因预测结果显示，SMAD1为miR-26a潜在的作用靶点，Leeper等[24]研究发现miR-26a可通过转化生长因子β(transforming growth factor β，TGF-β)信号通路调控平滑肌细胞的功能，SMAD1为其靶基因之一，而SMAD1是骨形态生成蛋白通路的重要转录因子[25]。骨形态生成蛋白对多种细胞（如内皮细胞）的增殖、分化、凋亡具有调控作用[26]，AS是动脉壁对血管内皮细胞损伤的一种慢性炎症过程[27]。因此miR-26a可能通过调节其下游靶基因SMAD1的表达在AS的发生发展过程中发挥重要作用。GO分析从生物学过程、细胞组分和分子功能三个方面对靶基因进行功能分析，结果显示差异miRNA的靶基因参与的生物学过程主要包括离子转运、定位、神经系统发育、细胞黏附、细胞分化、细胞增殖。这些生物学过程中很多都与内皮细胞生物学特性及AS的发生发展和急性缺血后细胞死亡相关[27-28]。

本研究采用高通量测序技术检测患者血浆miRNA的差异表达谱，结果显示AS患者及LAA性卒中患者血浆miRNA表达谱既有差别又有相同之处，但本研究仅通过生物信息学技术对miRNA的靶基因进行预测和功能分析，具体的机制仍需进一步基础和临床实验研究。

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【点睛】

采用高通量测序技术建立无症状性脑动脉粥样硬化及大动脉粥样硬化性卒中患者血浆微小RNA差异表达谱。