苹果渣发酵饲料中性洗涤纤维含量及影响因素研究

■陈姣姣 来航线 马军妮 薛泉宏

(西北农林科技大学资源环境学院，陕西杨凌712100)

目前我国普遍采用的养殖模式为高能精饲料喂养。精饲料中蛋白质等主要成分对畜禽养殖的重要性不言而喻，但饲料中的纤维成分对维持畜禽营养及健康必不可少。研究表明，精饲料日粮中性洗涤纤维(NDF)过低，导致奶牛物质代谢障碍，乳脂率下降及易出现亚急性瘤胃酸中毒[1-2]，引发母猪便秘及胃溃疡等问题[3]。适当提高NDF水平可弥补精饲料不足，达到促进瘤胃发酵，提高纤维消化率[4]，改善母猪繁殖性能等效果[5-6]。NDF主要通过影响干物质采食量、瘤胃发酵内环境及营养成分消化率等达到维持畜禽健康的目的。NDF是国内外公认的评价饲料营养价值的重要指标之一。苹果渣是果汁加工副产品，主要由果皮、果核和残留果肉组成，富含碳水化合物及矿物质等多种营养物质，是重要的饲料原料,但苹果渣中蛋白质含量很低。现有研究重点集中在提高苹果渣发酵饲料的蛋白质含量的发酵工艺优化[7-8]，而对其中的NDF研究甚少。本文重点研究苹果渣固态发酵对其发酵产物中NDF的影响，旨在为NDF饲料原料开发及苹果渣发酵饲料营养品质综合评价提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌种：黑曲霉UA8（Aspergillas niger，缩写为 An）、白地霉B1410（Geotrichum candidum，缩写为Gc）、产朊假丝酵母C1314（Candida utilis，缩 写 为 Cu）及 酵 母 菌（Yeast，缩写为Y）均由西北农林科技大学资源环境学院微生物资源研究室保存。

培养基：黑曲霉UA8活化及孢子悬液制备分别用PDA固体培养基及麸皮培养基；白地霉B1410、产朊假丝酵母C1314、酵母菌活化及液体菌种制备分别用PDA固体培养基及PDA液体培养基[9]。

发酵原料：烘干苹果渣(眉县恒兴果汁有限公司提供)，玉米浆(商惠酒精厂提供)，尿素在市场购买。原料A为苹果渣∶尿素=19∶1；原料B为苹果渣∶玉米浆干粉∶尿素=17∶2∶1。

1.2 方法

发酵液制备：4株供试菌种经PDA固体斜面活化后，用无菌水制成菌悬液，将白地霉、产朊假丝酵母及酵母菌悬液接入PDA液体培养基中，28℃，120 r/min培养72 h，通过血球计数法测定细胞悬液浓度，再用无菌水稀释至4.09×108、2.78×108、4.50×108cfu/ml；黑曲霉接入麸皮固体培养基28℃培养72 h，待孢子大量形成后加入无菌水制备孢子悬液，用无菌纱布过滤后加无菌水调节孢子量为4.32×108cfu/ml。

方案：设发酵剂、灭菌及原料3个因素。发酵剂共8种：黑曲霉（An）、白地霉（Gc）、产朊假丝酵母（Cu）、酵母（Y）单菌发酵剂4种；白地霉+产朊假丝酵母（GcCu）、白地霉+黑曲霉（GcAn）、产朊假丝酵母+黑曲霉(CuAn)及酵母+黑曲霉(YAn)混菌发酵剂4种。灭菌：设120℃，30 min湿热灭菌和不灭菌自然发酵2种处理。原料设A（不添加玉米浆干粉）和B（10%玉米浆干粉）2个处理。以未接菌处理作为对照，以烘干纯苹果渣作为发酵原料对照，每处理重复3瓶。

固态发酵：称取原料A、B各50.000 g、按料水比1∶2加水拌匀，加入到600 ml组培瓶中,不灭菌处理直接接入发酵剂（单菌接种量为6 ml，混菌各3 ml），灭菌处理经120 ℃，30 min湿热灭菌，待冷却后按同样接种量接入发酵剂。接种后充分混匀，28℃培养72 h，40℃烘干粉碎备用。

NDF测定：准确称取固态发酵烘干粉碎样品0.500 g，加入100 ml中性洗涤剂及2～3滴正辛醇，盖上玻璃漏斗，快速煮沸并持续保持微沸1 h。样品消煮完毕趁热过滤，先用热水冲洗至洗液中无泡沫，抽干后用丙酮冲洗至滤液无色，再用乙醚冲洗2次，最后将玻璃砂漏斗和剩余物放入105℃烘箱烘干至恒重[10]。

中性洗涤纤维及发酵产物中残留蛋白质测定：称取NDF测定烘干剩余物0.200 g于小三角瓶中,常规凯氏法消煮,半微量法定氮,再乘以系数6.25换算为纯蛋白质[11]。用相同方法测定发酵产物中蛋白质含量。

结果计算：NDF发酵增率(△f)、接菌增率(△i)、灭菌增率(△s)、玉米浆增率(△r)用下式计算：

式（1）中，Co、Cf分别表示苹果渣原料、发酵产物NDF含量；式（2）中，Cck、Ci分别表示未接菌、接菌发酵后NDF含量；式（3）中，Cn、Cs分别表示未灭菌、灭菌发酵产物NDF含量。式（4）中，Ca、Cb分别表示原料A、B发酵产物NDF含量。以上公式中NDF单位均为g/kg。

1.3 数据分析

采用SAS软件中的ANOVA程序对数据进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同发酵剂发酵产物的NDF（见表1、表2）

表1 自然发酵产物NDF含量

表2 灭菌发酵产物NDF含量

由表1可知，在未灭菌自然发酵条件下，苹果渣发酵产物具有较高的NDF含量。在原料A中，发酵产物的NDF含量为436.16～538.83 g/kg，单菌发酵剂产朊假丝酵母、白地霉、酵母及混菌发酵剂黑曲霉+白地霉发酵产物的NDF含量为493.03～538.83 g/kg，高于其余单菌及混合发酵剂（436.16～462.00 g/kg）（P<0.05）；单菌黑曲霉An及其他混菌发酵可使产物中的NDF下降11.8%及0.3%～10.2%。在原料B中，发酵产物的NDF为444.37～496.73 g/kg,不同发酵剂发酵产物的NDF含量均无显著差异（P>0.05），且较纯苹果渣原料的NDF下降0.6%～10.6%（酵母菌除外）；在所有接种剂中，两种原料均以单接黑曲霉An处理发酵产物NDF含量最低。

由表2看出，采用灭菌发酵模式时，发酵产物中的NDF含量及在发酵中的变化与自然发酵类似。在原料B中，发酵产物的DNF为414.67～518.00 g/kg，除接种GcCu外，其余发酵剂及对照处理的发酵增率△f及接菌增率△i均降低，且各发酵剂之间无差异显著（P>0.05）。在原料A中，发酵产物的DNF为397.61～496.67 g/kg，除An外，其余发酵剂处理的NDF均无显著差异。以单接An处理发酵产物NDF含量降低幅度最大，原料A、B的NDF较不接菌对照分别降低11.0%、12.3%。

在表1、表2中，发酵增率△f表示发酵产物与发酵原料纯苹果渣的差异，接菌增率△i表示接入发酵剂与不接发酵剂时发酵产物中NDF的差异。从表1、表2看出，与苹果渣原料相比，在发酵过程中部分NDF分解，导致发酵产物中的NDF含量降低；与不接菌相比，接种不同发酵剂时NDF含量略有差异，但大部分差异未达到显著水平。

2.2 灭菌对NDF含量的影响

表3 灭菌及玉米浆对NDF含量的影响

由表3△s看出，灭菌可降低发酵产物中NDF含量。在原料A中，除接种发酵剂CuAn的NDF较未灭菌处理略有增加（4.4%）外，其余发酵剂接种处理NDF含量较未灭菌处理降低1.2%～16.3%；在原料B中，除CK、接种剂GcCu及Gc的灭菌增率略有增加外，其余接种处理的降幅为2.8%～8.4%。

2.3 玉米浆对NDF的影响

由表3△r可知，玉米浆对发酵产物NDF的影响与接菌、灭菌处理有密切的关系。在自然发酵条件下，单接菌处理添加玉米浆发酵产物NDF含量降低，混菌发酵大部分处理NDF含量增加（CuAn除外)。在灭菌条件下，混菌发酵处理添加玉米浆发酵产物NDF含量降低(GcCu除外)，单接菌则相反。因此，在添加玉米浆时，应均衡考虑其他条件。

2.4 中性洗涤纤维中的残留蛋白质

蛋白质是由氨基酸构成的高分子物质，仅在酸、碱或蛋白酶的作用下发生水解反应。本试验采用国标提出的中性洗涤纤维分析方法缺少除去蛋白质的处理措施，由此推测，用该方法获得的中性洗涤纤维中会含有较多的残留蛋白质。表4测定结果证实，由4种代表性发酵产物处理得到的中性洗涤纤维中确实含有较多蛋白质。

表4 灭菌处理原料B发酵产物及其中性洗涤纤维中蛋白质含量

从表4可知，由灭菌处理原料B及其发酵产物所得中性洗涤纤维中的残留蛋白质含量为30.70～53.32 g/kg，且接菌处理蛋白质残留率高于不接菌对照。

3 讨论

本试验采用白地霉、产朊假丝酵母、酵母及黑曲霉组成的8种发酵剂进行苹果渣固态发酵。供试菌种对发酵原料NDF有两种影响，其一，发酵初期细胞呼吸和菌体的生长繁殖导致可溶性，碳水化合物被分解利用,残留物为难以降解的组分，NDF质量分数增加；其二，发酵过程中由于纤维素酶等水解酶作用NDF含量降低，菌体蛋白形成，蛋白质含量提高。黑曲霉生长繁殖过程中合成的大量胞外纤维素复合酶，将纤维素分解为小分子糖类[12-13]，可达到大幅度降低NDF含量的作用。白地霉、产朊假丝酵母及酵母菌主要作用是将底物中的非蛋白氮及黑曲霉糖化的小分子糖类转化为菌体蛋白，以达到提高蛋白质及降低NDF含量的效果。但这些菌种不产纤维素酶，故对NDF含量的降低幅度很小。

苹果渣原料中加入玉米浆为微生物提供了丰富的营养条件。在灭菌发酵条件下，黑曲霉与酵母便形成了互利共生关系，酵母菌消耗黑曲霉酶解产生的简单糖用于自身的生长繁殖，同时，简单糖的利用降低了小分子糖对黑曲霉纤维素酶合成代谢的反馈抑制作用，促进了菌体生长和产酶代谢，提高了纤维素酶活性，促进了中性洗涤纤维水解，导致NDF下降。

经灭菌处理原料熟化，有利于灭菌处理中接入菌快速生长及水解酶类合成，促进了发酵产物中大分子碳水化合物水解。因此，灭菌处理下的发酵产物NDF含量低于自然发酵。

采用国标中性洗涤纤维分析方法对发酵产物进行分析，发现经该方法处理后的中性洗涤纤维中蛋白质残留量达到30.70～53.32 g/kg，远高于被认为是饲粮纤维的细胞壁镶嵌蛋白或细胞壁蛋白的含量[14]。推测残渣中的蛋白质可能是中性洗涤剂不能溶解的大分子蛋白及微生物细胞蛋白。故采用国标法测定结果会高估发酵饲料中NDF含量。建议对该法进行改进研究，增加蛋白质的水解过程，消除残留蛋白质对测值的影响，以准确反映发酵饲料中NDF含量。

4 结论

苹果渣发酵饲料NDF含量较高，可作为NDF原料用于饲料生产；发酵对苹果渣原料中的NDF有降低作用；采用国标提出的中性洗涤纤维测定方法测定苹果渣发酵产物的NDF含量时，所得NDF测值偏高，其中的残留蛋白质较高。应对该方法进行改进研究，增加蛋白质酶解措施。