家蝇新型抗菌肽A3基因的克隆与分析

□ 耿文一 杨 雪 唐 婷 柳峰松

一、引言

随着抗生素的滥用和超级耐药细菌的产生，昆虫抗菌肽已成为新型抗菌药物设计和开发的重要资源。家蝇中已经报道的抗菌肽有攻击素(attacin)，天蚕素(cecropin)，防御素(defensin)和溶菌酶(lysozyme)［1］。抗菌肽的获得可以通过许多方法，例如采用提取纯化的方式获得，但是提取工艺繁琐;有研究是通过真/原核表达来表达纯化抗菌肽［2］，由于抗菌肽的抑菌能力较强，该方法的成功率较低;也有研究运用抑制性消减杂交方法成功获得免疫相关基因［3］。本文通过分析家蝇基因数字表达谱和转录组数据，发现细菌刺激后多条未知基因表达量显著升高。分析其中1条基因编码的多肽发现具有抗菌肽的典型特征，同时实验证实根据其成熟肽合成的多肽具有广谱抑菌活性。此基因是在家蝇中首次被发现的，并且在GenBank中找不到同源基因，将其命名为A3。

二、材料与试剂

(一)实验材料。家蝇Musca domestica(Linnaeus)种蝇由中国科学院动物研究所何凤琴老师惠赠，幼虫由本实验室饲养，饲养温度为25℃，相对湿度为50% ～70%。

(二)主要试剂。实验室所用试剂是TaKaRa公司产品，有RNAiso Plus、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、pMD19-T载体、SYBR Green;南京金斯瑞科技有限公司产品有M-MLV反转录酶、Taq DNA聚合酶;苏州金唯智生物有限公司合成引物。由上海默悉生物科技有限公司合成A3合成肽(纯度大于95%)。

(三)主要菌种。攻毒实验所用大肠杆菌(Escherichia coli ATCC25922)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)为本实验室所保存。抑菌实验所用菌种由中科院动物研究所朱顺义研究员馈赠。革兰氏阳性菌:巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，藤黄微球菌(Micrococcus luteus)，脲芽孢八叠菌(Sporosarcina ureae);革兰氏阴性菌:嗜水汽单胞菌(Aeromonas hydrophila)，根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，大肠杆菌(Escherichia coli)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。

三、实验方法

(一)总RNA的提取和反转录。按照使用说明书，用RNAiso Plus试剂提取家蝇幼虫的总RNA，经琼脂糖凝胶电泳检测其完整性后，利用核酸定量仪测定其浓度和纯度，各取1μg 总 RNA，以 AOLP(5＇-GGCCACGCGTCGACTAGTACT16(G/A/C)-3＇)为引物反转录合成cDNA。

(二)A3基因cDNA序列的克隆。参照家蝇转录组序列信息，设计A3基因特异正向引物A3-F1(5＇-AACCACATTACGCTAACACG-3＇)和特异反向引物 A3-R1(5＇-CATTAAATCGCGAGCCCTTTTTGA-3＇)，以家蝇幼虫 cDNA为模板，进行 PCR 扩增，PCR 反应条件为:94℃、4min;94℃、30s，55℃、40s，72℃、1min，35 个循环;72℃延伸，10min。PCR 产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离、切胶回收后，连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α化学感受态细胞，PCR筛选阳性克隆后测序。

(三)A3抗菌肽的生物信息学分析。将上述测序结果进行生物信息学分析，利用Bioedit软件搜索开放阅读框(Open reading frame，ORF)，翻译成氨基酸序列。利用Signal 4.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)查找信号肽。成熟肽分子量、等电点及氨基酸组成在Antimicrobial Peptide Database(http://aps.unmc.edu/AP/)中预测。在NCBI网站上利用 Blastp程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行相似性比对。

(四)A3成熟肽合成。将A3成熟肽氨基酸序列VQRVLFPICTKGPFLHSLRDTDSLGRQLDPYVIR YQKKFGST发送到上海默悉生物科技有限公司进行合成。

(五)A3合成肽的抑菌活性实验。将实验菌株在37℃，220 rpm条件下震荡过夜。将活化后的菌种以1%接种量接种到新鲜的液体培养基中，当OD600=0.2左右时，停止摇菌。将各菌株菌液用新鲜培养基稀释100倍，备用。将A3合成肽用无菌水进行梯度稀释，浓度分别是1 mM、200 μM、100 μM、20 μM、2 μM、0.2 μM、20 nM 和 2 nM。

我们对本实验室的细菌菌谱进行大范围的检测。取其中一株细菌的稀释菌液加入96孔板中，每孔加入菌液90 μl;多肽稀释液以不同的浓度分别加入细菌稀释液中，加入量为10 μl，23℃，100 rmp 震荡培养 12 h。同时以分别加入 10 μl无菌水和10 μl氨苄青霉素(0.1 g/ml)作为阴性和阳性对照组。在OD600下检测实验组和对照组菌液的浊度，来判断其是否具有抑菌活性，并测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，MIC定义为与阴性对照组相比实验组达到85%以上细菌死亡的多肽浓度。所有不同浓度的样品要进行3次平行实验。

(六)A3合成肽的溶血活性测定。抽取1 ml的兔静脉血，立即与阿氏液(Alsever＇s Solution)混匀。用生理盐水洗涤血细胞，2000 rmp，离心5 min，弃上清。用50倍体积生理盐水重悬血细胞，并以200 μl每支分装到1.5 ml离心管中。将多肽A3用生理盐水稀释成浓度梯度，分别为1 mM、204 μM、102 μM、20.4 μM、2.04 μM、0.204 μM、20.4 nM 和 2.04 nM。200 μl血细胞加入 4 μl肽液，37℃孵育30 min。3000 rmp，离心5 min，收集上清，在分光光度计上测定416 nm处吸光度值。阳性对照为用生理盐水稀释的10%Triton-X-100;阴性对照为生理盐水。溶血率计算方法:溶血率(%)=［(AB)/(C-B)］×100%(A:实验组吸光度值;B:阴性对照组吸光度值;C:阳性对照组吸光度值)。

四、结果

(一)家蝇A3基因cDNA序列及分析。经PCR克隆，获得家蝇A3基因cDNA序列254 bp，包含198 bp完整的开放阅读框，5＇末端非翻译区12 bp，3＇末端非翻译区44 bp。推导的A3多肽序列由65个氨基酸残基组成(图1)，图中划线部分为信号肽。成熟肽富含Leu(11.90%)和Arg(9.52%)(图2)，疏水性氨基酸为14个，带正电荷的氨基酸为8个，理论分子量为4881.4 D，等电点为9.86。Blastp分析后未发现A3基因的同源性序列。

通过对抗菌肽二级结构分析，A3成熟肽是由β-折叠和α-螺旋构成(见图3)。从三级结构预测图中可以看出，在C端有1个α螺旋，N端有2个反向平行的β片层(见图4)。

图1 家蝇抗菌肽A3基因cDNA序列及其推导的氨基酸序列

图2 A3成熟肽的氨基酸组成

(二)A3合成肽的抑菌实验结果。我们用实验室已有的菌株来进行抑菌实验。A3合成肽对多种细菌都有抑制作用，其中抑制作用最高的为革兰氏阴性菌Serratia marcescens，其MIC 为30.73 μM。

(三)A3合成肽溶血实验结果。从溶血实验结果可以看出，合成肽的终浓度为1 mM时，其溶血效率为19.1%，说明A3对哺乳动物血细胞具有较低的溶血活性。

图3 A3成熟肽的二级结构

图4 A3成熟肽的三级结构

五、结语

本文根据家蝇EST序列筛选到一种新型的家蝇抗菌肽A3基因，合成A3成熟肽对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌具有抑制作用，且几乎没有溶血活性，因此A3在医药领域具有一定应用潜力。本研究不但从家蝇体内发现了一种新型抗菌肽，在新抗菌肽的发现方法方面也有独到之处，在基因组学和转录组学迅速发展的今天，利用生物信息学作为指导，结合分子生物学实验验证，获得新基因是一种方便可行的方法，可突破生物化学方法分离蛋白的难关，会加快新型抗菌肽的研发进程。

［1］Boman HG，Faye I，Gudmundsson GH，Lee JY，Lidholm DA.Cell-free immunity in Cecropia.A model system for antibacterial proteins［J］.Eur J Biochem，1991，201(1):23 ～ 31

［2］耿华，安春菊，郝友进，李德森，杜荣骞.家蝇攻击素(Attacin)基因的克隆与表达［J］. 遗传学报，2004，12:1344～1350

［3］Ito Y，Nakamura M，Hotani T，Imoto T.Insect lysozyme from house fly(Musca domestica)larvae:possible digestive function based on sequence and enzymatic properties［J］.J Biochem，1995，118(3):546～551