无菌结晶原料药工艺模拟试验研究

□ 刘永丽

根据药品生产质量管理规范(2010年修订)，无菌原料药工艺是指法定标准中列有无菌检查项目的原料药，应最大限度地控制微生物［1］。无菌结晶原料药是指采用结晶精制工艺进行生产的非最终灭菌原料药，其生产工艺通常为粗品溶解后经过除菌过滤进入结晶釜结晶，过滤烘干后进行分装，且还包括辅助工序。无菌结晶原料药的工艺模拟试验(Process simulation validation)通常是指使用合适的空白物料或微生物生长培养基，运用与无菌物料生产方法相接近的方法评估无菌工艺。［7］无菌工艺模拟试验确定无菌工艺生产系统是否有染菌风险，即培养基模拟灌装试验［1］。

一、无菌结晶原料药生产工艺分析

无菌结晶原料药的生产流程包括液体和固体两个阶段，粗品溶解后经过除菌过滤进入结晶釜的结晶、过滤、烘干等过程为液体阶段，烘干物料的分装为固体阶段。无菌工艺模拟试验工艺应涵盖溶液通过除菌过滤器后至分装结束，但不涵盖粗品的溶解过程。

二、无菌工艺模拟试验前的准备

在无菌工艺验证前，对其生产设备的设计和确定有着十分重要的意义［3］。无菌工艺模拟试验前应确保生产设施设备、公共系统、仪器仪表、人员等均已经过确认并在确认有效期内，并保证无菌工艺模拟试验期间的正常运行。

(一)生产设施确认。一是洁净区高效泄露测试合格;二是层流区域烟雾测试确认气流流向未紊乱;三是从洁净区消毒效果和洁净级别应能满足操作要求，并确定监控方案对环境进行监测;四是洁净区温湿度满足产品生产要求，并使人员穿着无菌衣舒适。

(二)公共系统确认。一是确认水系统(包括纯化水系统和注射用水系统)的安装和供水质量满足生产需求;二是确认直接接触产品或无菌设备的压缩空气系统、氮气系统满足生产要求，包括微粒、微生物等;三是确认纯蒸汽系统能够满足生产需要，如设备和无菌衣的灭菌、直接接触产品的包装材料和工器具的灭菌等。

(三)设备确认。一是确认生产设备性能满足产品生产要求;二是确认生产设备材质和设计满足清洁要求;三是确认生产设备灭菌效果能满足要求，无灭菌死角;四是确认设备的密闭性能满足设计要求，并经过泄漏测试合格。

(四)仪器仪表校验。一是确认仪器仪表均经过校验并在校验有效期内;二是仪器仪表精度和型号满足生产要求。

(五)除菌过滤器。确认除菌过滤器效果经过验证，包括过滤器材质与产品的兼容性，过滤效果确认，过滤器的完整性测试等。

(六)无菌生产工艺。无菌生产工艺流程和工艺参数，各工序操作时限等均已确认，并评估确认最差条件。

(七)人员。一是无菌操作人员已经过资质确认，包括GMP知识、微生物知识、无菌操作培训、无菌更衣确认等;二是无菌操作人员数量和职责确认;三是无菌操作区域管理人员资质和职责确认;四是QC取样和过程监测人员资质和职责确认;五是QA过程监控人员资质和职责确认;六是维修人员资质和职责确认。

三、模拟介质的选择

为了保证无菌工艺模拟试验结果的可信性，应根据生产工艺和生产环境选择适当的模拟介质。模拟介质应具备以下要求:一是对微生物生长无抑制作用，且能够促进微生物生长。二是模拟介质在培养基溶液中要有较好的溶解度。模拟介质最终会与培养基溶液进行混合培养，培养结果通常是通过观察培养基溶液的澄清度进行判定。三是模拟介质不能影响培养基溶液的促生长效果。需要对模拟介质加入培养基溶液后溶液的促生长效果进行确认，确定其不影响培养基溶液的质量。四是模拟介质应易于清洗，并对设备没有腐蚀性［6］，无毒，不污染环境。每次无菌工艺模拟试验后均应对设备进行彻底清洗，并确认清洗效果。

四、培养基的选择

(一)培养基种类选择。通常应根据微生物种类选择培养基。若工艺中存在厌氧菌，可选择硫乙醇酸盐液体培养基。但通常产品的生产工艺与空气接触，适合大多数微生物的生长，污染厌氧菌的几率较小。试验用培养基应能够支持较宽的微生物生长的菌谱，能促进革兰阳性菌、革兰阴性菌、酵母菌和霉菌的生长。通常选择常用的TSB(Tryptic Soy Broth大豆胰蛋白培养基)作为模拟试验用培养基。

(二)培养基浓度选择。作为培养的TSB培养基溶液通常选择常用的微生物检测浓度，如3%TSB培养基溶液，以保证培养基溶液的促生长效果。若选择其他浓度，需要确认在该浓度下培养基的溶解性以及对微生物的促生长能力的影响。

五、模拟介质的灭菌

模拟介质若本身受到污染或灭菌不彻底，会导致无菌工艺模拟试验呈现假阳性结果。因此，要确保模拟介质的无菌性。在进行无菌工艺模拟试验之前，需要对模拟介质进行取样检测其无菌性。

(一)无菌工艺液体阶段模拟介质的除菌。无菌工艺液体阶段模拟介质可采用除菌过滤器进行除菌，过滤器的选择可根据模拟介质的性质进行调整。若无菌工艺使用的是疏水性过滤器，而模拟介质溶液为水溶液，可将无菌工艺使用的疏水性过滤器更换为适合模拟介质溶液的亲水性过滤器。过滤器的除菌能力不需要通过无菌工艺模拟试验进行验证，因为过滤器的除菌能力已经通过挑战性试验确认，且其灭菌条件也经过了灭菌工艺验证。

(二)无菌工艺固体阶段模拟介质的灭菌。无菌固体灭菌方法很多，包括伽马射线灭菌、湿热灭菌等等。无论采用何种灭菌方法，都需要对灭菌效果进行确认，以保证模拟介质的无菌性。也可采用市售的无菌模拟介质固体，但该模拟介质供应商应经过资质确认，确保其提供模拟介质的无菌性。

六、培养基的灭菌

培养基的灭菌同模拟介质一样，若企业自行灭菌，均需要对灭菌工艺进行验证。对于灭菌后的培养基溶液，均需要进行促生长试验。促生长试验可采用接种枯草芽孢杆菌和白色念珠菌，接种量均少于100CFU，在20～25度培养3天，再在30～35度培养2天，各管培养基中接种微生物均应明显生长。

七、无菌工艺模拟试验工艺的设计

无菌工艺模拟试验工艺设计应综合考虑生产线可能发生污染的各种因素［4］，并避免不利于微生物生产的因素。模拟试验过程参数的选择如下:

(一)温度。无菌原料药结晶工艺通常包括升温和降温过程，考虑对微生物的生长影响，建议在整个模拟过程采用易于微生物生产的温度，如25～30℃，避免高温或低温等影响微生物生长的环境。在溶解阶段，考虑模拟介质的溶解速度，可采用加温的方式加快模拟介质的溶解速度，但在压滤进入结晶釜前，应将溶液降温至适当的温度(25～35℃)，以确保溶液温度不影响无菌段可能的微生物的生长。

(二)压力。对于抽真空工艺，考虑微生物在缺氧情况下影响其生长的因素，因此可采用模拟抽真空的动作，即抽真空至需要的真空度后，保持一定时间后，进行破真空，使设备内达到常压，确定抽真空操作对无菌生产的影响。抽真空的次数根据工艺要求而定，通常不少于工艺要求次数。对于加压操作，若工艺采用压缩空气进行加压，可模拟工艺过程;若工艺采用洁净氮气进行加压，则需要将氮气更换为压缩空气。氮气通常通过气体除菌过滤器进入设备，替代的压缩空气也要通过相同的气体除菌过滤器进入设备，以保证气体除菌过滤器后的气体管道也被覆盖到。

(三)过程取样和加料操作。根据生产要求，在生产过程中的取样操作必须在无菌工艺模拟试验中进行模拟。即采用与生产相同的操作进行取样。取样获得的样品不能丢弃，需要保留进行无菌检查。若生产过程中存在加料操作，可采用模拟介质代替晶种，模拟加晶种的操作，以确认该操作不会影响产品的无菌性。

(四)操作时限。无菌工艺模拟试验必须达到或超过产品生产工艺的最长条件。如结晶时间、过滤时间、干燥时间、分装时间、无菌包装材料的存放时间等，尤其是产品暴露在环境中的时间。这些在设计无菌工艺模拟参数时必须进行考虑。

(五)模拟介质的数量。模拟介质的数量应考虑对设备表面的全覆盖，至少大于产品生产工艺的数量。

(六)其他参数的选择。对于参数的选择原则是不影响微生物的生长，并能够模拟生产过程中可能存在无菌风险的操作。如结晶过程中的搅拌操作，搅拌速度过快对微生物操作有影响，且其可能存在无菌风险，因此在模拟时，应确定搅拌速度，若生产时要求搅拌速度较快，可在模拟时搅拌较短时间后，降低搅拌速度，或间歇搅拌。若溶解结晶采用的是有机溶剂，考虑有机溶剂对微生物生长的影响，可将有机溶剂调整为水溶液。

八、干涉活动及样品取样

无菌工艺模拟试验必须考虑生产过程中可能出现的非正常操作，如抽真空的真空泵突然停止、分装过程中包装容器翻倒、分装数量调整等。这些非正常操作可通过实际操作进行积累，在定期的无菌工艺模拟试验中进行模拟。模拟的次数根据实际发生概率而定。每次模拟涉及的样品根据需要进行取样标识，评估其对无菌操作的影响。如分装过程中出现容器侧翻，认为调整后进行分装，若该包装最终污染，且确认为该操作引起的，在实际生产中发生该操作，则需要采用其他方式处理，如丢弃该包装容器。

九、环境监测

为确保无菌工艺模拟试验的可靠性，在模拟试验过程中需要对环境进行监测，包括洁净区悬浮粒子、浮游菌、沉降菌、设备表面菌、人员表面菌。对洁净区的环境监测不应少于日常的环境监测，尤其是对无菌区域的监测，需要考虑环境取样对无菌操作的影响。无菌工艺模拟试验应尽可能在恶劣的环境下进行，通过将操作人数增加到最大来达到此目的。在环境监测过程中，所有产品暴露操作的环境都需要进行监控。［5］

十、样品培养和结果检查

样品的培养要求对样品进行全培养，不能随意丢弃样品，除非样品明显被污染，且污染的原因很明确。

(一)液体阶段样品。采用液体介质进行培养时，若溶液量较小，可采用将所有溶液分装并加入无菌培养基的方式进行培养。但通常的商业化生产中，溶液量均较大，将溶液分装并加入培养基的过程中，很难不对溶液造成污染，造成假阳性试验。可参照无菌检查的方式，采用除菌过滤器对溶液进行全过滤后，对除菌过滤器进行培养。除菌过滤器至少采用0．45um级除菌过滤器。过滤结束后，将除菌过滤器在无菌环境下进行外表面消毒，将过滤器内残留溶液放入无菌容器，过滤器也取出放置在无菌容器中，加入预先灭菌的培养基溶液，密封后进行培养。

(二)固体阶段样品。固体阶段采用固体模拟介质模拟分装过程，将模拟介质分装如包装容器后加入预先准备的灭菌后培养基溶液，密封振摇后，进行培养。加入培养基溶液后，其量至少是容器装量的2/3，在培养过程中翻转容器即可保证对容器的全覆盖。应取2件进行阳性试验，确认在该条件下微生物能够生长。

(三)样品培养结果检查。无菌工艺模拟试验样品需进行全培养，培养条件应与无菌检验条件相同，即先在较低温度(20～25℃)下培养7天，然后在较高温度(30～35℃)下培养7天。考虑从较低温度到较高温度的升温过程，可适当延长较高温度的培养时间。

对于液体阶段的过滤器，可先将过滤器振摇、翻转，闻培养基的气味是否为培养基特有的淡淡的气味;如果长菌，会有有别于无菌培养基的臭味。观察培养基溶液外观是否为黄色清亮透明;如果长菌，黄色会变浅，溶液浑浊、不透明。如果长霉菌，培养基溶液会澄清，溶液内会漂浮着朵状霉菌菌落。取出过滤器，再用手电筒照射检查过滤器壳内是否有遗漏的菌斑。每支滤芯外表面用“菌落计数器”仔细照射检查。滤芯内表面用手电筒照射检查。无菌的滤芯滤纸表面应略有发黄，颜色浅，色泽均匀。长菌的滤芯会有菌斑，发黑，呈点状，不均匀的。

对于固体阶段的培养容器，可将容器振摇、翻转，打开后，将培养基溶液倒入到无菌透明PE袋内。立即观察外观性状。再用手电筒照射检查铝听、胶塞内表面是否有遗漏的菌斑。

(四)培养结果判定。若发现污染应对微生物污染的样品进行鉴别试验，鉴别的内容至少应包括菌落、细胞形态学及革兰染色特性等。

(五)试验样品培养基促生长试验。对于样品的检查应在无菌环境下进行，在液体阶段和固体阶段培养样品合格的情况下，还需要对培养后的培养基取样进行微生物促生长试验，以确定培养基的促生长能力，以免出现假阴性结果。

十一、无菌工艺模拟试验结果评价

(一)合格结果判定。一是批生产操作涵盖模拟设计中列出的最差条件;二是培养基促生长试验合格;三是过程样品检查符合检测要求;四是所有培养产品无污染;五是环境监测合格。

(二)失败结果调查。若试验有污染，应调查:一是生产环境微生物监测数据;二是生产环境悬浮粒子监测数据;三是人员污染的监测数据;四是HEPA过滤器的完整性检测、粒子、风速等;五是操作间的空气流向、压差;六是操作人员的操作方法、培训情况;七是模拟试验过程中的异常情况;八是无菌室生产工具及其他用品的储存状况;九是鉴别污染微生物的种、属，以寻找污染源的线索;十是无菌室的清洁、清洁堆规程的培训及执行情况;十一是无菌生产用设备的控制系统和监测系统的校正;十二是生产前、生产后过滤器的完整性检测结果;十三是相关产品、相关生产过程存在的问题等。

原因调查结束后，应根据调查所确定的或可能发生的原因制定纠正或改进方案并予以实施，并评估对已经生产产品无菌性的影响。当改进方案实施之后应重复模拟试验。

十二、无菌工艺模拟试验方案和报告

无菌工艺模拟试验应制定方案，并在实施后形成报告，内容至少包括以上内容。在无菌工艺模拟试验后，还需要进行清洁效果确认，以保证模拟试验介质不会污染生产设备和环境。

［1］国家食品药品监督管理局药品认证中心．药品GMP指南·无菌药品［M］．北京:中国医药科技出版社，2011，8:1

［2］翟铁伟．无菌原料药的无菌工艺验证［J］．医药工业设计杂志，2004，25(4):31 ～34

［3］张凤．无菌原料药的无菌工艺验证［J］．科技创业家，2014，4(下):216

［4］李妮，刘智勇．新版GMP中对无菌工艺验证要求的探讨［J］．设备验证与 GMP，2011，12(12):20 ～24

［5］薛红霞，刘敏，林巍．无菌原料药的无菌工艺验证［J］．河北企业，2013，7:133 ～134

［6］梁书臣，张素霞，刘树林等．无菌原料药的无菌工艺验证探讨［J］．工艺探讨与系统设计，2009，1(1):44～48

［7］梁毅，贺聪．无菌原料药生产工艺验证过程的研究［J］．中国药房，2012，23(41):3849 ～3852

［8］美国FDA-无菌工艺生产无菌产品工业指南-cGMP(2004-9)

［9］PDA_TR No．28:Process Simulation Testing for Sterile Bulk Pharmaceutical Chemicals，2006

［10］PDA_TR No．22:Process Simulation for Aseptically Filled Products，2011