心脏干细胞活化相关分子在心血管疾病中的作用

邱光昊 ，张正斌 ，翟蒙恩 ，程 亮，刘 洋，孙云蕊，宋思敏，梁宏亮，刘金成

·综述与进展·

心脏干细胞活化相关分子在心血管疾病中的作用

邱光昊1，张正斌1，翟蒙恩2，程 亮2，刘 洋2，孙云蕊1，宋思敏1，梁宏亮2，刘金成2

胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor，HGF)在许多干细胞中都发挥积极作用，心脏干细胞(cardiac stem cells，CSCs)作为研究比较多的对心肌缺血性疾病有重要治疗作用的细胞也日益受到重视。近年来发现CSCs活化对于治疗的意义非常明确，而IGF/HGF是激发其活化态的重要分子，并且二者作用的信号通路有一定重叠，对于研究CSCs活化的分子机制有重要作用。二者还可以促进CSCs的迁移、促进增殖、抗凋亡等。

心血管疾病； 心脏干细胞； 胰岛素样生长因子-1； 肝细胞生长因子

心脑血管疾病已经成为威胁人类生命的第一杀手，其中心肌缺血性疾病危害最大。心肌梗死通常会对机体造成不可逆的心功能损害，从而影响患者预后以及生活质量。现有治疗只停留在提高心功能和减轻心脏负荷上，尚不能重建心肌，因此迫切需要能修复坏死组织并显著提高心功能的治疗手段。已有研究表明心脏干细胞(CSCs)移植具有诸多优点，细胞因子作用下的心脏干细胞比单纯干细胞移植更明显地改善心功能，在治疗方面拥有很大的潜能。

1 CSCs治疗心脏疾病相关进展

心肌组织在新生儿期存在自我更新能力，成年阶段的心肌组织更新能力受限。并且随着年龄的增长，主质细胞的数量和功能会不断降低。因此，对于组织缺损相关疾病的诊治大多停留在发挥和保留残留主质细胞的功能上。

2002 年，Quaini 等[1]首次在人体心脏中发现了一类可分化细胞，具有干细胞的特征。Beltrami等[2]在成年大鼠心脏中发现可表达cKit+受体的细胞。内源性CSCs存在于不同物种的哺乳动物中包括人类[3]。最近的研究显示哺乳动物的心脏中存在一群固有的干细胞，活化后能够迁移入梗死的心肌组织中，重建受损组织并改善心室功能，新生的心肌组织包含心肌的各种细胞和血管，证实成人心脏在受损后具有额外的生长潜能[4]。植入梗死区的CSCs具有分化成心肌细胞、平滑肌细胞和血管内皮细胞的能力，进而生成具有收缩功能的肌肉组织、微脉管系统和结缔组织[3]。在成人的心肌组织中，大多数干细胞处于沉默状态，少部分经活化后参与修复坏死的心肌细胞和血管细胞。在缺氧、超负荷压力等应激条件下，相当一部分干细胞被迅速激活，参与组织修复[5]。

心脏细胞治疗代表了心脏疾病治疗的新领域，研究显示这种治疗能够改善心脏结构和功能，并且移植的干细胞能够使梗死区减小、变薄。CSCs发挥作用的机制主要包括直接分化和旁分泌，直接分化指由干细胞增殖分化形成心肌细胞，是细胞治疗的主要方式。另一种机制是“旁分泌假说”，该假说认为移植的CSCs所分泌的细胞因子、生长因子等作用于心肌组织才是CSCs发挥治疗作用的主要机制[6-7]。另外，有学者发现CSCs表达相应的胰岛样生长因子α-1(IGF-1)以及肝细胞生长因子(HGF)受体，提示自分泌反馈机制的存在，即CSCs可以通过自分泌IGF-1和HGF作用于自身受体发挥相应作用。

CSCs受到细胞因子和生长因子的激活促使其移行、分化、增殖，从而替代损失的心肌细胞。小鼠经干细胞移植1周后，可在梗死区检测到HGF和IGF-1，同时在远离梗死区和中隔部位也可检测出，浓度随时间延长而降低[7]。肝细胞生长因子-c-甲硫氨酸系统(HGF-c-Met)和胰岛素样生长因子1-受体系统(IGF-1-IGF-1R)发挥了重要作用[8]。在此就这两种活化系统进行讨论。

2 CSCs在HGF/IGF-1作用下的生物学效应

IGF-1/HGF属于干细胞因子(stem cell factor，SCF)是糖基化的跨膜蛋白，在间质细胞、成纤维细胞、内皮和心肌组织均可表达。心肌梗死时IGF/HGF的浓度迅速增加[9]，CSCs本身也可分泌IGF-1/HGF[7]，也有实验在体外通过采用含有IGF-1/HGF的培养基培养CSCs[8]。

CSCs能够促进心肌细胞的存活、增殖、减少纤维化和心肌细胞反应性肥大。在体外实验中发现CSCs的分化作用增强，最终减小梗死面积、改善左室功能。CSCs移植到缺血性心肌组织并接受IGF-1和HGF的活化证实了IGF/HGF有以下功能：①通过冠脉向梗死区域注入小剂量IGF-1/HGF能够促进心肌存活和修复重建，对心肌组织结构有很强的保护作用；②冠脉内IGF-1/HGF能够激活内源性CSCs以发挥其分化发育成肌细胞以及修复因缺血性损伤导致的微脉管系统缺失，形成中等血管、阻力血管以及微血管；③CSCs受活化的强度、心肌的存活和细胞增殖都直接受到IGF-1/HGF剂量依赖性的调控；④IGF-1/HGF通过减少细胞死亡、减小梗死面积和预防左心室扩张来改善心功能[10]。

大多数的CSCs都表达c-Met和IGF-1受体。相关研究显示生长因子活化的CSCs无血清培养基的上清液中，HGF和IGF-1浓度增长很快，在30 min～120 min分别增长了13倍和26倍。在体内的增长包括鼠HGF和IGF-1的mRNA和蛋白质。这些证据表明CSCs拥有综合处理这些生长因子的能力，并且在体外HGF和IGF-1的浓度增长呈时间依赖性的现象更明确地支持该结论。因此CSCs拥有HGF-c-Met和IGF-1-IGF-1R系统[4]。

100 ng/mL HGF可趋化CSCs。HGF在趋化试剂盒里能使7倍数量的CSCs聚集起来。IGF也有一定的趋化能力。在HGF的作用下，CSCs能溶解明胶并分泌金属蛋白酶MMP-2和MMP-9，IGF同样对MMP具有一定的作用。在实验中发现IGF-1和HGF能分别降低CSCs94%和58%的凋亡率，IGF-1活化的CSCs的数量增加了11倍而HGF则增加了3倍[4]。同时，HGF可以通过促进MMP-9的分泌破坏细胞外基质从而促使细胞移动、归巢和组织重构[11- 12]。因此通过注射HGF分子可促进CSCs向梗死区域迁移和归巢。

3 IGF-1与HGF作用于CSCs的分子机制

3.1 IGF-1与CSCs

3.1.1 IGF-1-IGF-1R作用机制 IGF-1与受体结合可激活酪氨酸激酶，磷酸化细胞内底物如胰岛素受体底物-1(insulin receptor substrate-1，IRS-1)和Shc激活下游信号分子，包括PI3K/Akt通路。IGF-1R通过若干个酪氨酸磷酸化位点发挥作用，通过募集胰岛素受体底物-2(insulin receptor substrate-2，IRS-2)并使其磷酸化从而活化下游PI3K分子。PI3K磷酸化磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1 (phosphoinositidedependent protein kinase1，PDK1)[13]。活化的PI3K能使4，5-二磷酸磷脂酰肌醇PtdIns(4，5)P2和PtdIns(4)P发生D3磷酸化，产生PtdIns(3，4，5)P3和PtdIns(3，4)P2，而PtdIns(3，4，5)P3能被磷脂磷酸酶转变为PtdIns(3，4)P2。积累起来的PtdIns(3，4，5)P3和PtdIns(3，4)P2募集包含血小板-白细胞C激酶底物(PH)结构域的Akt添加到质膜上，被PH结构域覆盖住的Thr308被暴露出来。随后，PDK1所包含的羧基端PH结构域磷酸化Thr308。尽管磷酸化Thr308能够局部磷酸化Akt，羧基端Ser473的磷酸化对于诱导Akt的全面活化是必需的。然而Ser473的磷酸化机制仍然未能了解，因此，作用于此部位的激酶被认为是“PDK2”。在某些情况下PDK1能够磷酸化两个结构。Ser的自身磷酸化也有报道。整联蛋白连接的激酶(ILK)能够磷酸化Ser473，而这种机制是否作为直接磷酸化“PDK2”仍存争议[14]。

最近的研究数据显示CSCs的衰老能导致心肌细胞衰老和心衰，随着其不断衰老，其细胞功能也会丧失。并且随着年龄增长不断缩短端粒酶的CSCs，其子代细胞会遗传母代细胞的短端粒酶表型。经过数轮分裂后会表达衰老相关的蛋白 p16INK4a[15]。IGF能够促进CSCs分裂、上调端粒酶功能、阻止细胞复制性衰老。IGF还具有减少氧化应激的功能[16]。

3.1.2 IGF-1R下游信号通路主要包括 ①IGF-1-PI3K-Akt-eNOS途径，Akt的活化能够促进多种靶蛋白的磷酸化，包括内皮一氧化氮合酶(eNOS)，通过使用LY294002封闭PI3K-Akt信号阻止Akt/eNOS活化，结果使心肌细胞凋亡率和梗死面积增大[9]。心肌梗死后PI3K-Akt-eNOS信号通路的表达明显增强。结果表明IGF分子的作用可以通过活化PI3K-Akt-eNOS信号通路实现。②IGF-1-Ca2+途径，IGF-1能够通过活化1，4，5三磷酸肌醇受体(1，4，5-triphosphate receptors，IP3Rs)来诱导细胞内钙震荡(Ca oscillatory)，可以促使钙离子从内质网中释放从而发挥CSCs的促有丝分裂作用。然而此通路具体级联作用机制并不清楚[17]。③IGF-1-PI3K-Akt-FoxO3a途径， Akt另一个重要的下游信号分子是FoxO3a，具有负向调控细胞周期的作用。Johnson AM通过使用LY294002和渥曼青霉素以去除IGF-1对于FoxO3a的磷酸化作用证明其磷酸化受到PI3K-Akt途径的调控。并发现IGF-1介导的CSCs增殖作用与FoxO3a的磷酸化和其转录活性的失活有关[18]。

3.2 HGF与CSCs

3.2.1 HGF-c-Met作用机制 HGF结合Met二聚体使其酪氨酸激酶活性被激活，在其酪氨酸残基Y1349和Y1356上发生磷酸化。磷酸化的Met与细胞内底物结合如Gab1、Grb2和PI3K。Gab1能够结合磷酸化的Y1349，Grb2能够结合磷酸化的Y1356。大部分Gab1和Grb2包含SH2结构域。磷酸化的Gab1的底物是Shp2、PI3K和磷脂酶C。磷酸化的Grb2结合ras和raf，raf激活MAPK，ras激活ERK[19]。

3.2.2 c-Met下游信号通路HGF-PI3K-Akt途径 研究显示HGF同样具有与IGF-1相同的PI3K-Akt通路，激活eNOS发挥减缓梗死后疾病进程的作用[9]。Akt能够激活众多下游信号分子，然而涉及CSCs的相关研究较少，具体通路缺乏证据。

3.2.3 基因治疗 如今有药理学和基因手段通过移植入经过基因修改的干细胞来促进肌组织的再生。主要有以下几种方式：①修改体内的原位干细胞；②增强细胞增殖和分化能力；③在受损肌组织中增加细胞数量并增强其存活能力[20]。CSCs本身只表达低水平的HGF和Met[21]，固有的CSCs大多处于静止态[22]，HGF可以使静止态的CSCs活化，通过移植HGF过表达的CSCs可发挥其自分泌作用正反馈促进CSCs的活化。到目前为止，有研究通过对脂肪衍生干细胞采用HGF基因转移的方式促进HGF表达从而减弱缺血性损伤的影响[23]。另外，HGF还能够诱导胚胎干细胞表达心脏特异性标志[21]。

另一种方式是将腺病毒5介导的HGF基因通过冠状动脉灌注的方法转移入心肌组织中，使心肌组织过表达HGF从而改善心功能，并得到如下结果：①心肌组织能够高表达HGF；②表达CD117和c-Met的干细胞数量增多明显；③心功能有显著改善[24]。

4 展 望

综上所述，HGF和IGF-1对于CSCs的活化起到了相当重要的作用，干细胞移植作为近年来新兴的治疗方式让心肌梗死病人的预后得到了改善，也让心肌梗死的治疗得到了很大的发展，然而HGF和IGF-1分子在其他干细胞(如间充质干细胞)的试验中被证实可通过多条信号通路(涉及包括ERK和MAPK等分子在内)发挥作用，其中涉及CSCs的相对较少。在不同的试验中所取得的实验结果不尽相同，对相应心脏功能并无根本性改善，有关的处理方式、注射部位、注射时间等还有待试验验证。如今CSCs的研究大多停留在动物实验的层面，长期实验相关的安全性、可行性还有待进一步确认。同时，自体CSCs的分离纯化培养需要数周时间，费用较高、操作复杂繁琐，这都阻碍了干细胞移植的发展。相信日后会有更简便快捷的分离提纯方法并能够更好地应用。

通过相应研究的进展，发现通过基因转染等方式将表达相应生长因子的基因转移至能够稳定表达的细胞中并使其在心肌组织定居。转基因表达的HGF等分子通过旁分泌的机制使其维持较高浓度，持续促进CSCs的活化，可以发挥改善心功能、阻止疾病进展的作用。同时，也可探索将相关基因转入CSCs内一并移植入心肌组织中持续表达，通过自分泌机制分泌HGF、IGF-1等分子直接作用于CSCs细胞膜表面的受体发挥积极作用。

可以预见，随着研究的不断深入，干细胞移植对于心梗患者的治疗将开辟一条崭新的道路。

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(本文编辑 王雅洁)

Cardiac Stem Cells Activiton Related Molecules and Its Function in Cardiovascular Diseases

Qiu Guanghao，Zhang Zhengbin，Zhai Meng’en，Cheng Liang，Liu Yang，Sun Yunrui，Song Simin，Liang Hongliang，Liu JingCheng The Fourth Military Medical University，Xi’an 710032，Shaanxi，China

Corresponding Author：Liang Hongliang(XiJing Hospital， the Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，Shaaxi，China)

Insulin-like growth factor (IGF)-1 and hepatocyte growth factor (HGF) in many stem cells play a positive role.Cardiac stem cells(CSCs)，as an important therapeutic stem cells to myocardial ischemic disease are getting increasingly attention.In recent years found that the treatment meaning of the activation of CSCs is clear.HGF/IGF-1 are the important molecules to excite the activation state of CSCs，and they have some overlap signaling pathways.They can also promote CSCs migration，proliferation，apoptosis，etc.

cardiovascular diseases；insulin-like growth factor；hepatocyte growth factor；cardiac stem cells

国家自然科学基金资助(No.81200151，81200708)

1.中国人民解放军第四军医大学(西安 710032)，E-mail：1907955671@qq.com；2.第四军医大学西京医院

梁宏亮，E-mail：dr.lianghongliang@hotmail.com

R54 R256

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.17.010

1672-1349(2015)17-1946-04

2015-08-27)