血浆miRNAs在急性病理期缺血性脑卒中的表达谱分析

陈 烜,侯玉立,李伟荣,张 栋,何芙蓉

血浆miRNAs在急性病理期缺血性脑卒中的表达谱分析

陈 烜1,侯玉立2,李伟荣3,张 栋4,何芙蓉3

目的探讨缺血性卒中在病理分期的急性期(24 h内)外周血浆中miRNA的表达及临床意义。方法选取急性脑梗死患者和健康对照者各5例。收集急性脑梗死患者发病24 h之内的血浆和健康对照者的清晨空腹血浆。采用TaqManmicroRNA Arrays进行miRNAs表达谱筛选。使用相关统计学软件及统计方法进行数据分析。结果与健康对照组相比,在缺血性脑卒中发病24 h内外周血浆中存在差异表达的miRNA。本研究共检测有统计意义的显著差异表达的miRNA 66个,其中表达上调的39个,下调的27个。上下调倍数变化最显著的miR 4498上调7.84倍(foldchange=7.84),miR 676-5P下调为0.167(fold change= 0.167),P均<0.05。结论急性缺血性脑卒中发病24 h内外周血浆中即存在差异表达的miRNA,这些差异表达miRNA可能与缺血性卒中早期的缺血缺氧应激,血脑屏障破坏,早期再灌注损伤等有关,也有可能作为缺血性卒中早期干预新的治疗方向和靶点。

缺血性卒中;急性病理期;血浆miRNA

缺血性脑卒中是危及我国人民健康的高发疾病,目前已有治疗方法对缺血性卒中发病急性期积极干预,但缺血性卒中的致残率仍很高。微小RNA(m-i croRNA,miRNA)是目前生命科学研究领域的焦点[1],可以通过与靶mRNA完全或不完全互补配对的方式在转录后负向调控靶mRNA表达,参与了许多疾病的病理生理过程,外周血浆中存在可以反映疾病变化的miRNA[2]。本研究使用基因芯片技术,研究miRNA在急性缺血性卒中24 h内与健康对照比较外周血浆中miRNA的变化,旨在建立缺血性卒中发病急性期内的外周血浆表达谱,初步筛查在急性缺血性卒中早期起调控作用的miRNA,为急性缺血性卒中的早期治疗干预提供新的思路和潜在的治疗靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料 急性脑梗死患者5例,为太原市中心医院神经内科收住的急性缺血性卒中患者。所有患者符合1995年第四届全国脑血管病学术会议修订的诊断标准,均经详细的神经系统检查及头颅MRI影像学检查确诊。排除自身免疫性疾病,恶性肿瘤、高热、呼吸系统疾病等。对照组为5名健康志愿者,年龄、性别比例与患者相匹配。本研究所有标本的获取均经研究对象同意。

1.2 试剂与仪器 总RNA的提取采用TRIzol(Invitrogen)和miRNeasy mini kit试剂盒提取(Qiagen公司);使用microRNA miRCURYTmLNAArray(version 18.0)基因芯片筛选差异表达miRNA(丹麦Exiqon公司)

1.3 标本收集 5例急性缺血性卒中患者收集急性发病24 h外周静脉血。同时收集5名健康志愿者血浆。所有样本于清晨空腹采集。使用EDTA抗凝管收集外周静脉血6 mL,并轻轻上下颠倒混匀至于4℃冰箱保存,在1 h之内进行血浆分离。4℃2 000×g离心10min,取上层血浆移至1.5mL无RNA酶(RNasefree)离心管中。4℃1 600×g离心5 min,吸取上层浆至2 mL旋盖尖底无RNA酶(RNase-free)离心管中;装好置于-80℃冰箱保存备用。

1.4 血浆总RNA的提取和质控 采用TRIzo l(Invitrogen)和miRNeasy minikit试剂盒(Qiagen公司)提取RNA。提取的RNA进行质量检测,使用紫外吸收测定法Nanod rop TM分光记录仪会自动完成所检测RNA样品的质量,记录OD260/OD280二者比值。

1.5 miRNA芯片标记、杂交 使用microRNA miRCURYTmLNAArray(version 18.0)基因芯片筛选差异表达miRNA(丹麦Exiqon公司)。其LNA(locked Nuc leic Acid)锁核酸,为一种特殊双环状核苷酸衍生物,对RNA有很好地识别能力和强大的亲和力,可自由设定Tm值,使所有探针Tm值均一化,保证对所有的靶点具有相同的亲和活性。能检测到常规DNA探针无法检测到的极其微量的miRNA。每张芯片对同一样品重复4次,确保芯片的可靠性。采用miRCURYTMHy3TM/Hy5TMPower labeling kit(Exiqon,Vedbaek,Denmark)标记试剂盒,按照标准操作流程对样品RNA进行荧光标记。采用miRCURYTmLNA Array杂交试剂盒(v.18.0)(Exiqon)按照标准操作流程,对RNA进行杂交。

1.6 扫描机数据处理 使用Axon GenePix 4000B microarray scanner对芯片图形进行扫描。使用Genep ix V6.0读取原始图像强度值。芯片中每4个重复探针的实验结果取平均值。使用中位数将所有数据标准化处理。将miRNA中所有扫描信号强度大于30的样品去背景化矫正后,取这些数据的50%计算出median值。

1.7 统计学处理 对miRNA进行无人监督聚类分析,筛选出差异表达的miRNA。fold changce>1.5或者<0.6(P<0.05)。

2 结 果

2.1 血浆总RNA的质量 本实验获得的总DNA样本,经紫外吸收测定法Nanod rop TM分光记录仪检测,所有RNA样本的OD260/OD280>1.6,为质量合格的标本。

2.2 急性缺血性卒中发病24 h差异表达miRNA的芯片结果 与健康对照组相比,急性缺血性脑卒中患者在发病的急性24 h内,共检测到581个差异表达的miRNA。在581个差异表达miRNA中,425个为差异表达上调fo ldchange>1.5,156个为差异表达下调fo ldchange<0.6。经统计学分析有66个miRNAs的差异表达有统计学意义。66个存在显著差异表达miRNA,39个为差异表达上调,27个为差异表达下调;差异最显著的有miR4498上调7.84倍(fo ldchange= 7.8 4),miR 1 8 1 d-3 p上调4.2倍(fo ldchange= 4.72),miR 5196上调4.04倍(fo ldchange=4.04), miR 676-5p下调为0.167(fold change=0.167)。缺血性卒中发病24 h与正常对照组血浆中存在差异表达的miRNA。

3 讨 论

急性脑梗死的病理生理过程复杂,按照病理分期的界定,急性脑梗死在发病1 h~6 h为超早期,6 h～24 h急性期,24 h~48 h为坏死期,其后为软化期和恢复期[3]。而在不同的病理时期,脑梗死组织的分子细胞生物水平的变化不同[4],有学者认为缺血性卒中应该按其病理生理分期分型治疗。目前,公认对缺血性卒中治疗有效的超早期溶栓治疗[5],但因地域交通、文化程度、对疾病的认识度等局限,能够及时接受溶栓治疗的患者只有一部分,而且接受了溶栓治疗的患者中,也有一部分效果未尽如人意。因此更深的从细胞分子层面探索缺血性卒中发生的机制,为缺血性卒中早期的治疗寻找新理论基础和治疗方向,有实际临床意义。

微小RNA其强大的调控作用不仅参与了神经系统的发生[5]、发育、成熟,也参与调控了神经系统的疾病病理过程[6]。实验发现,缺血损伤后脑组织和血浆中的一些miRNA表达发生显著改变[6,7]。Dha rap[8,9],从缺血再灌注3 h开始持续到第3天, miRNA的表达一直处于动态变化中。Yuan[10]发现,全脑缺血模型大鼠,在缺血20 min,再灌注30 min和24 h时血浆和脑组织中miRNA表达水平均出现改变。不同的miRNA在缺血性卒中中发挥不同的调控作用,如mir126、130a、210、21等可调控促进血管形成[11]。miR124可以下调SCP1的表达,从而诱导胚胎神经发生,调控轴突生长过程[12]。小鼠动物模型实验研究显示miR124与卒中后脑组织损害有特异相关性,miR124在卒中8 h后血浆中浓度升高,在24 h急剧达到高峰[13]。这些研究说明了miRNA参与了急性脑梗死早期的疾病过程,并且调控了血管再生,神经修复等病理过程[14]。局限性脑缺血后因动脉血流灌注减少或血流完全中断,脑组织缺血缺氧应激,脑组织破坏崩解,出现一系列缺血造成的病理生理变化,称缺血瀑布。缺血瀑布是一系列级联反应,包括细胞因子促进炎症细胞黏附在血管内皮,破坏血脑屏障,增加脑水肿和细胞毒性酶释放等[15]。

本研究针对急性缺血性脑卒中发病的24 h内的血浆miRNA进行表达谱分析。在急性缺血性卒中的24 h内发现581个有差异表达的miRNA,经统计学分析,有66个有统计学意义(P<0.05)。这些在24 h出现显著差异变化的miRNA,推断与缺血性卒中启动、应激等病理生理机制有关。针对这些在缺血性卒中急性24 h内的miRNA的研究,可以使我们更深的了解“缺血瀑布”这一系列级联分子事件最开始状态的病理生理机制,并根据其作用的机制做出相应的干预,可以影响缺血性卒中的早期病理过程,或许可以成为缺血性卒中超早期干预治疗的潜在靶点。实验发现在有统计学意义差异表达的miRNAs中,表达差异最显著的有miRNA4498、miR181d-3p、miR5196、miR676-5p等,已有相关研究认为抑制miR181可以减少缺血性脑卒中诱发的神经元凋亡。

本研究丰富了血浆缺血性脑卒中miRNA差异表达谱。针对急性缺血性卒中24 h患者外周血浆中miRNA进行分析,验证了缺血性卒中的急性期的一系列病理变化受特定的miRNA调控,为寻找缺血性卒中急性期起主要作用的机制和相关miRNA提供了一定的理论基础。目前已在动物研究使用miRNA抑制剂调节相关miRNA,影响其下游蛋白的表达,对疾病病理状态产生治疗作用。本实验中筛选出来的在24 h出现显著差异的miRNA4498、miR181d 3p、miR5196、miR676-5p有望成为今后对缺血性卒中急性期干预的新的潜在治疗靶点。但对这些miRNA的具体作用靶点及机制还未明确,还需要进行大样本验证和进一步的靶基因研究。

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1672-1349(2015)07-0932-03

2015-03-11)

(本文编辑王雅洁)

山西省科技厅科技发展计划—社会出版项目(No.2013 313020-9)

1.山西医科大学附属第一临床医学院硕士研究生(太原030009);2.山西医科大学第一医院;3.山西省太原市中心医院;4.山西医科大学基础医学院

侯玉立,E-mail:ccccxuanxuan@163.com