沙眼衣原体体外持续性感染细胞模型的研究进展

白 顺 薛耀华 杨 斌 郑和平

沙眼衣原体体外持续性感染细胞模型的研究进展

白 顺 薛耀华 杨 斌 郑和平∗

沙眼衣原体(Ct)在感染上皮细胞整个过程中，Ct原体和网状体两种形态交替形成。然而，体外培养过程中，青霉素、IFN－γ、缺铁等可抑制RB向EB的转化，形成异型RB；当诱导因子去除后，网状体又重新转变为正常形态并开始分裂，表现为持续性感染状态。本文对体外Ct持续性感染细胞模型的相关因素以及方法学的研究进展作一综述。

沙眼衣原体； 持续性感染； 细胞模型

泌尿生殖道沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis，Ct)感染是最常见的性传播疾病之一。感染后可引起男性尿道炎及女性宫颈炎，但50%的男性和70%的女性Ct感染者不表现出临床症状。1治疗不及时可以导致附睾炎、前列腺炎、盆腔炎、异位妊娠等多种并发症。2近年来，阿奇霉素治疗的失败和Ct感染病例显著增加，然而并未发现Ct临床分离株耐阿奇霉素的基因突变，3体外药敏试验也显示敏感的最小抑菌浓度(MIC)。4细胞模型研究发现在γ－干扰素、青霉素等因素的干扰下，形成异型包涵体(aberrant inclusion body)，Ct可以利用这一机制逃逸宿主的攻击，在宿主细胞内保持长期感染，表现为持续性感染状态。本文就沙眼衣原体持续性感染的细胞模型研究进展作一综述。

1 持续性感染的定义

Ct属于原核细胞微生物，由于自身不能产生三磷酸腺苷，必须严格寄生在宿主细胞内，形成类似病毒的独特发育周期。原体(elementary body，EB，直径约0.2 μm)是成熟的衣原体，具有高度的感染性，但无繁殖能力。通过受体介导的吞饮作用进入胞内，形成包涵体，在包涵体内EB发育成网状体(reticulate body，RB，直径约0.8 μm)、RB无胞壁、无传染性，代谢活跃，以二分裂方式繁殖并发育成EB，包涵体随之逐渐胀大破裂，释放出EB。正常的发育周期约需48～72 h。然而γ－干扰素、抗生素以及其他因素可抑制RB向EB的转化，形成胀大的、低电子密度的RB，而包涵体体积变小，即异型包涵体(aberrant inclusion body)。5Ct进入异常生活周期，表现为细菌存活但无感染性的持续性感染状态，当去除有关因素后，又恢复到感染状态。

2 体外Ct持续性感染的相关环境因素

研究证实γ－干扰素、青霉素、四环素、喹诺酮类、去铁甲酰胺、热休克蛋白、生殖器疱疹病毒2型合并感染等均可以在体外诱导出异型包涵体细胞模型。5，62.1 抗生素 电子显微镜观察显示青霉素诱导的RB不能进行二分裂增殖，可见变大的畸形RB。当青霉素去除后，RB重新转变为正常形态并开始分裂，随后再转化为EB继续侵蚀其他细胞。7转录组学和蛋白组学研究结果显示，虽然畸形RB没有分裂，但其一直进行DNA复制和信使RNA合成。5McCoy等发现青霉素结合蛋白(PBP－1，PBP－2和PBP－3)与肽聚糖合成相关，而肽聚糖合成相关基因如murA等对Ct的生长非常重要。8Skilton等研究青霉素诱导的Ct体外培养持续性感染模型的生长周期发现，已经感染衣原体的细胞在一定浓度的青霉素刺激下能够继续形成异型包涵体，当去除青霉素后已经异常的RB并不能回到正常的尺寸，但却能够在去除10～20 h后重新进入正常发育周期。此外，诱导持续性感染期间，细胞的染色体和质粒复制并不受到影响。

除了青霉素外，环丙沙星、氯霉素、红霉素、阿奇霉素等一些抗生素具有诱导Ct持续性感染的作用。9衣原体感染的细胞后加入氯霉素，开始阶段EB转向RB阶段受阻，进而扰乱RB正常分裂。红霉素不仅能够抑制RB转向EB的分化能力，而且还会引起形成比正常RB小2倍的异型RB。红霉素结合到核糖体的50S亚基，减少RB核糖体的活性和随后的蛋白质的合成。蛋白质合成的减少，可能会导致在膜成分或所需的分化调节蛋白的缺乏。Dreses－Werringloer等学者观察环丙沙星和氧氟沙星两种抗生素作用E型Ct效果的体外细胞学实验中发现，抗生素可引起异型但有活性的Ct颗粒形式，虽然不能感染细胞，但培养液中存在具有代谢活性的EB。10

2.2 IFN－γ和氨基酸饥饿 目前IFN－γ在沙眼衣原体持续性感染模型应用中最多。Beatty等研究指出IFN－γ通过诱导IDO建立持续性感染模型。9IDO是一种促色氨酸降解的酶，而色氨酸是Ct生长中必不可少的氨基酸，因此IFN－γ能够诱导产生Ct生长停滞现象，且Ct不具有感染性。当给予吲哚，Ct可以重新回到正常的生长周期中。此外，这种现象是生殖型(D－K型)Ct所仅有的，因为生殖型Ct的色氨酸合成酶基因trpBA把阴道菌群分泌的吲哚转变为色氨酸，促使IFN－γ诱导的Ct不会完全缺乏色氨酸而死亡，建立持续性感染的状态，而其它型Ct的Trp操纵子突变引起色氨酸合成酶失去活性。随后，Beatty等继续发现IFN－γ诱导感染细胞后的Ct形态转变为异型RB，尽管这些RB的细胞膜结构组分缺少MOMP蛋白和LPS脂多糖，但是其仍能继续合成和分泌免疫破坏性抗原HSP60。HSP60能引起慢性炎症输卵管病理改变，进而引起盆腔炎、异位妊娠和不孕不育。

Belland等通过转录组学分析IFN－γ诱导感染HeLa细胞的D型Ct，结果显示在异型包涵体形成过程中，包括DNA修复和重组、蛋白翻译等在内的许多相关基因呈明显上调趋势，而蛋白质水解、肽转运、细胞分裂、RB到EB转变和EB的DNA浓缩相关基因却呈下调趋势。11Ct对IFN－γ介导的色氨酸饥饿应答反应主要包括经典的EB－RB－EB生长周期转录组应答，以及异型包涵体持续性感染生长状态和Ct交替形态逃避的免疫应答等。研究表明，从Ct感染小鼠的脾脏中获得抑制性T细胞能够杀死朗格汉斯细胞感染的异型包涵体。12

Ct是完全细胞内寄生细菌，因此从宿主细胞中获取营养物质是Ct生长所必需的。当蛋白合成抑制剂放线菌酮加入至Ct感染的细胞培养液后，宿主细胞失去了吸取营养物质的能力，Ct变得更大且更容易发现。早期研究表明，富营养的M199培养液或EMEM基础培养液中培养的纤维细胞感染Ct，前者比后者的感染程度更明显。13Coles等学者做了L2型Ct感染细胞在不同氨基酸浓度的EMEM中培养的比较。培养液中氨基酸浓度降至10%时，48 h后Ct包涵体内含有大量异型RB，当加入半胱氨酸或异亮氨酸后成熟的RB可逐渐转变为EB。14

2.3 铁元素缺乏 所有的原核生物维持正常生理活性时均需要铁的存在。Ct等细胞内寄生细菌也需要铁才能进入哺乳细胞进行复制分裂繁衍后代。E型Ct感染HEC－1B细胞的培养液中添加铁螯合化合物，会引起持续性感染。重新添加转铁蛋白的培养液后，感染恢复到正常状态，RB重新转到EB。15LaRue等研究发现缺铁易引起Ct Hsp60蛋白表达上升。16随后Richard等进一步研究发现在Hsp60－1、Hsp60－2和Hsp60－3三个Hsp60蛋白同系物中，能够引起Ct持续性感染的是Hsp60－2蛋白。Dill等采用蛋白组学分析缺铁诱导的RB蛋白表达的变化，研究指出RB通过抗氧化损伤的蛋白和转运相关蛋白表达升高适应缺铁的生长环境。17Thompson和Miller等分别采用DFO和Bpdl建立以诱导缺铁引起的Ct持续性感染模型，发现铁结合蛋白YtgA显著升高，且后者诱导效果要比前者效果更明显。18，19另有研究指出，生殖道Ct感染是年轻女性的一种常见疾病，月经周期中体内铁的浓度变化容易导致Ct持续性感染向正常感染转变。13

2.4 宿主细胞分化 单核细胞感染Ct后，细胞内有大量异型RB；当单核细胞分化为巨噬细胞，正常的RB和EB重新出现。此外，K型Ct在单核细胞、滑膜组织和正常Hep－2细胞中培养均有相同结果。20Ct在正常生长过程中，糖酵解、戊糖酸途径、三羧酸循环、电子传递链、σ因子等11种与生长周期有关的因子其基因水平均呈上调趋势；当异型包涵体形成后，除胞质分裂外，染色体复制相关因子的基因水平均呈下调趋势。

Ct感染子宫内膜未分化上皮细胞后能够形成异型RB，上皮细胞随后转移至黏膜表面并分化成正常RB。13另有研究指出，最初的猪腺上皮细胞感染Ct后可形成异型RB型感染，逐步形成持续性感染状态；而深入分化的猪管腔上皮细胞则形成正常Ct生长状态，管腔细胞中的Ct不断生长繁殖对上皮组织造成损伤，并且开始释放大量的EB。21

此外，MCF－7乳腺癌细胞诱导分化的腺上皮细胞感染Ct后可形成不同时期的感染形式和异型包涵体。22宿主细胞分化依赖的完全细胞内寄生细菌的复制与宿主没有区别。人乳腺癌病毒的繁殖高度依赖由基底细胞分化的鳞状上皮细胞，HPV病毒长期感染基底细胞容易引发持续性感染。

2.5 HSV合并感染 一项研究表明，当E型Ct感染

HeLa细胞24 h后，宿主细胞再次感染HSV－2型病毒会出现异型RB。23但是，Deka等研究得出Ct和HSV－2共感染HeLa细胞并不是引起异型包涵体所必须的。Ct感染上皮细胞后加入紫外线灭活的HSV病毒，能够诱导Ct持续性感染。HSP60蛋白表达升高。感染HSV的细胞降解后，Ct持续性感染消除，重新回到正常感染状态。6从HSV－2感染子宫颈内上皮细胞和子宫颈图片的相关临床数据来看，体内缺乏HSV和Ct共感染的情况下，Ct感染的细胞有多种途径与HSV病毒配体结合。首先，HSV感染产生每空斑形成单位20～200个缺陷的病毒颗粒，有缺陷的病毒颗粒共感染细胞可能比合并感染有复制能力的HSV更常见。其次，感染细胞释放出的病毒糖蛋白可通过作用衣原体感染的上皮细胞受体产生持续性感染。另外，HSV感染的细胞表面或细胞内，Ct感染的细胞和病毒糖蛋白都能相互作用。

3 Ct体外持续性细胞模型探讨

大多数文献报道的Ct体外持续性模型均采用IFN－γ诱导产生，但在Ct型、感染细胞、培养液等方向上没有绝对金标准，因此本文将进一步对IFN－γ诱导引起的持续性模型进行深入的探讨。

3.1 沙眼衣原体型别 文献报道表明，不同型的Ct均能通过诱导产生持续性感染。Kokab等采用E型Ct感染细胞，在100 ng/mL的 IFN－γ诱导后能降低56%的包涵体数量；24Morrison等深入分析IFN－γ诱导不同型Ct之间产生持续性感染的差异，其结果显示在A、B、Ba、G、I和J型Ct中，当IFN－γ诱导浓度为0.2 ng/mL时，包涵体数量降低了99%，敏感性最强。IFN－γ诱导浓度为0.5 ng/mL时，C和F型Ct感染的包涵体EB数量与对照组相比同样降低了99%，而D/ L1/L2/L3型Ct的抗IFN－γ干扰能力较其他型更强，需要5 ng/mL以上的IFN－γ才能达到其他型包涵体的降低程度。25Rodel等研究发现5 ng/mL IFN－γ作用的D型Ct虽然异型包涵体数量与对照组相比只下降了20%，但其包涵体内的EB几乎消失，失去了再次感染的能力，这与Kokab的研究结果非常相似。

3.2 感染细胞的种类 Ct主要感染上皮细胞，因此在体外Ct持续性感染模型的建立中，选择Hela、Mc-Coy和Hep－2等一些上皮细胞系最常见，其中最常见的为Hela 229细胞。McCoy细胞起源于小鼠成纤维L细胞，生长力旺盛，营养要求低，具有不受控增殖性，Ct可以感染McCoy细胞并在其中形成包涵体。此外，近年来的有不少采用Hep－2细胞做为Ct感染的对象，24许多研究学者认为Hep－2细胞比Hela 229细胞更容易受到衣原体的感染。

3.3 培养液的选择 细胞基础培养液主要采用DMEM、MEM和RPMI1640三大类，一般血清含量为10%，血清类型为FCS或FBS。MEM培养液是现在细胞培养中最基础的，含有最基本的必需氨基酸、维生素、糖类以及无机离子等成分，可基本满足一些像McCoy细胞等营养要求不高的细胞生长需求。DMEM是高糖培养液，在MEM培养液上添加了几倍的营养成分，细胞生长相对较快。而培养液中的生长因子，需要另外添加血清。目前主要采用FCS(小牛血清)和FBS(胎牛血清)两种血清，含量均占到整个培养液的10%，后者营养成分比前者多，且支原体含量较小。目前Ct感染细胞培养液相互之间的差别还未有报道，需要进一步探讨。

4 Ct持续性感染模型之间的相关性

已有相关基因组学、转录组学和蛋白组学对沙眼衣原体通过青霉素、IFN－γ和缺铁等诱导因子诱导的持续性模型相互比较。26异型包涵体形态差别不大，且没有相关权威的研究表明不同持续性模型之间存在基因表达的差别。2IFN－γ介导的持续性模型中，MOMP表达降低，HSP60表达上升。Nicholson等发现青霉素作用Ct后，异型RB的ompA/groEL基因转录表达没有变化。5相反的，Mathews等发现IFN－γ诱导的衣原体表达MOMP蛋白的ompA基因呈上调趋势。27此外，Gerard等报道处于对数期生长的K型Ct，HSP－60－1/groEL基因显著表达，而在铁元素缺乏诱导的异性包涵体中，HSP60－2/CT604基因mRNA和蛋白水平均明显升高。随后LaRue等研究用E型Ct也证实了以上铁元素诱导的异性包涵体的结果。因此，当前的结果表明，不同的诱导模型其衣原体转录应答机制有所不同，当然还需要后续更多的探讨研究。

5 结语

Ct持续性感染是一个复杂的免疫调控反应，一般情况下无症状，不易于临床诊断。近年来已有不少相关耐药性报道，抗生素治疗效果不理想。对于Ct持续性感染体外细胞模型的研究，将有助于了解和掌握其具体的感染机制。同时可通过体外模型的建立，模拟体内持续性感染状态，探索临床诊断和药物治疗的新方法。

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(收稿:2014－06－12 修回:2014－10－16)

Review on cell model persistently infected with Chlamydia trachomatis in vitro

BAI Shun，XU Yao-hua，YANG Bin，et al.Guangdong Provincial Dermatology Hospital，Guangzhou，510091

The normal developmental cycle of Chlamydia trachomatis(Ct)is alternated between elementary bodies(EB)and reticulate bodies(RB)in the process of Ct infecting human epithelial cells.However，in vitro，EB become enlarged and developed into the aberrant RB after induced by penicillin，interferon－γ and iron，et al.The aberrant RB returns to normal and cells division continues again after the inducer is removed.This paper aims to summarize the influence factors on cell model persistently infected with Ct in vitro and the development in the model construction.

chlamydia trachomatis；persistence；cell model

广东省皮肤病医院，广东广州，510091

∗通信作者