实时核酸恒温扩增技术在奈瑟菌感染检测中的应用

郑雅萍，袁青，陈伟

（金华市中心医院，浙江 金华321000）

实时核酸恒温扩增技术在奈瑟菌感染检测中的应用

郑雅萍，袁青，陈伟

（金华市中心医院，浙江 金华321000）

目的探讨实时核酸恒温扩增技术（SAT法）在淋病奈瑟菌感染检测中的应用价值。方法取153例疑似淋病奈瑟菌感染的女性患者宫颈分泌物标本采用直接涂片法、分离培养法及SAT法进行淋病奈瑟菌检测，同时对对应的153份尿液标本也进行SAT法的淋病奈瑟菌检测，对结果进行比较分析。结果淋病奈瑟菌检测中直接涂片法阳性率为31.4%，分离培养法阳性率为47.7%，SAT法阳性率为51.6%，SAT法与分离培养法检测淋病奈瑟菌阳性率差异无统计学差异（P＞0.05），而直接涂片法淋病奈瑟菌阳性率较低，与分离培养法比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；以分离培养法作为金标准，SAT法的检测敏感性为95.9%（70/73），特异性为88.8%（71/80）；采用SAT法对153例患者的拭子标本和尿液标本进行检测，两者检测结果的符合率为100%。结论SAT法检测女性宫颈分泌物拭子标本和尿液标本中的淋病奈瑟菌敏感性高、特异性强，能有效提高检出率；以尿液代替拭子标本，采样方便。

淋病奈瑟菌；直接涂片法；分离培养法；实时核酸恒温扩增技术

淋病（GU）是由淋病奈瑟氏菌感染引起的性传播疾病（STD），以泌尿生殖道化脓性炎症为主要特点，在世界上广泛流行，我国发病率也较高，由于其临床表现缺乏特异性，诊断主要依靠实验室检查。传统的检测方法有直接涂片法、分离培养法等，随着核酸检测技术的快速发展，PCR技术广泛应用于临床，实时核酸恒温扩增技术（simultaneous amplificationand testing，SAT法）成为一种最新的检测手段。该技术作为新一代的核酸扩增检测技术，被广泛地应用到病原体检测、病毒筛查等领域。本文通过对153例临床疑似女性淋病患者的标本采用直接涂片法、分离培养法以及SAT法进行淋病奈瑟菌检测，并对结果进行比较分析，为临床医生正确选择检测方法提供参考，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择2013年1月～2014年3月来本院妇科门诊就诊的临床疑似女性淋病患者共153例，年龄18～55岁。所有病例均具有以下一种或多种临床表现：尿道口红肿、分泌物明显增多、脓性白带，尿频尿急尿痛等。

1.2标本采集 每个患者取3份阴道分泌物拭子标本和1份尿液标本。拭子标本采集:妇产科医师用特制无菌棉拭子伸入女性宫颈口约1～2cm，旋转1周，停留10秒钟后采集分泌物标本，一式三份，分别置于无菌采样管立即送检。其中1支拭子采样后将拭子在1.5mL生理盐水中洗涤。将该洗液震荡混匀后吸取1mL至另一只装有1mL样本保存液（SAT试剂盒组分）的标本冷冻保存管中，并混匀；置于-20℃保存备用，用于SAT检测。尿液标本采集：长时间（至少1小时）不排尿后的首段尿1mL与1mL尿液保存液（SAT试剂盒提供）混合，即为待测样本，于-20℃保存，用于SAT检测。

1.3检测方法 标本采集后立即进行涂片革兰染色，油镜下查找革兰阴性双球菌，以在多形核白细胞内或胞外发现革兰阴性双球菌即为阳性。另取一支拭子接种于T-M专用巧克力培养基，置35℃、5%CO2环境培养24～48小时，将培养获得的可疑菌落严格按鉴定程序进行鉴定。另取已留取的尿液标本和拭子洗脱液标本进行SAT法的淋病奈瑟菌

检测。快速革兰染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司，培养基购自上海科玛嘉微生物技术有限公司，采用生物梅里埃VITEK2全自动细菌鉴定及药敏分析系统和配套试剂鉴定分析。SAT法检测试剂盒和核酸提取仪由上海仁度生物科技有限公司提供，LightCycle480荧光定量PCR仪购自Roche公司，严格按照操作说明书进行相关检测。

1.4 统计学处理 数据分析采用χ2检验。

2 结果

2.1拭子标本淋病奈瑟菌检出率 直接涂片法阳性率为31.4%（48/153），分离培养法阳性率为47.7%（73/153），SAT法阳性率为51.6%（79/153），SAT法与分离培养法检测淋病奈瑟菌阳性率差异无统计学差异（P＞0.05），而直接涂片法淋病奈瑟菌阳性率较低，与分离培养法比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

2.2SAT法检测拭子标本淋病奈瑟菌的敏感性和特异性 以分离培养法作为金标准，SAT法的检测敏感性为95.9%（70/73），特异性为88.8%（71/80）。

2.3SAT法对拭子和尿液标本的检测符合率 采用SAT法对153例患者的拭子标本和尿液标本进行检测，阳性79例，阴性74例，与拭子检测结果符合率为100%。

3 讨论

我国女性淋病的患病率 （0.08%）高于男性（0.02%），但女性淋病患者可以无典型临床症状而被忽视，约有60%的女性淋病患者无明显自觉症状，呈隐性感染或带菌状态[1]。无症状女性淋病患者在传播淋病奈瑟菌感染中起重要作用。因此，在孕前体检中早期筛查出女性淋病患者对预防新生儿淋病、执行优生优育政策有重要意义。

奈瑟菌检测的方法多样。传统的直接涂片法虽然操作简单、耗时短、费用省，但对女性慢性奈瑟菌感染患者或经抗生素治疗后的病例，因淋病奈瑟菌数量减少，且可以发生形态变异，涂片镜检难以区分阴道分泌物中的杂菌与淋病奈瑟菌，常出现假阴性结果，故其阳性检出率较低。有文献报道直接涂片法对急性期患者的标本具有初步的诊断价值，但对无症状即慢性期的男女性标本阳性检出率很低[2]。培养法一直是WHO推荐的诊断淋病的“金标准”，其阳性结果即有诊断意义，可以弥补直接涂片法的形态学辨认困难的缺点，提高检出率。但由于淋病奈瑟菌对环境和营养要求较高，离开人体后很快死亡，且有自溶酶，因此对标本的采集、运送要求较高，同时还可能因标本量过少、抗生素的使用、接种后病原微生物不成活等因素而导致检测假阴性。

SAT法是建立在RNA恒温扩增和实时荧光检测技术基础上的第二代核酸检测技术，其基本原理是同一温度下，首先通过M-MLV逆转录酶产生靶标核酸RNA的1个双链DNA拷贝，然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个RNA拷贝，同时带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光，该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，实时反映扩增循环情况，利用荧光信号的变化通过计算机对起始RNA进行分析[3]。其检测的是病原体RNA，因活菌中才有完整的RNA片段，因此相当于检测活菌，有利于临床用药后的疗效监测及预后判断[4]。RNA在环境中极不稳定，容易降解，降低了核酸扩增检测中交叉污染引起的假阳性问题，污染概率小。本研究中SAT法与分离培养法检测淋病奈瑟菌阳性率差异无统计学差异（P＞0.05），而直接涂片法淋病奈瑟菌阳性率较低，与分离培养法比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。

另外，以分离培养法作为金标准，SAT法的检测敏感性为95.9%（70/73），特异性为88.8%（71/80），敏感性和特异性均较高。本研究中通过拭子标本和尿液标本的平行检测，结果两者检出阳性率一致，说明了在取样时可以以尿液标本代替拭子标本，取材较为方便。

在本研究中出现SAT阳性而直接涂片法阴性的病例，可能的原因有患者经过治疗，病情减轻转化成慢性炎症，导致淋病奈瑟菌数目明显减少，或者是分泌物中其它杂菌的干扰导致，淋病奈瑟菌形态变异难以辨认等[5]。SAT法阳性而培养法阴性，可能的原因有标本采集量太少，运送过程保温不当致菌体死亡，培养条件不当，抗生素使用等易引起培养法的假阴性。SAT法阴性而培养法阳性，可能由于SAT检测的是病原体RNA，RNA在环境中极易降解，标本保存不当或特异性核酸序列突变[6]均可引起SAT法假阴性。SAT法特异性强、敏感度高，特别对于临床症状不典型的疑似病例或经抗生素治疗后的女性淋病患者，能提高检出率，对于疑似病例的早期诊断具有重要临床意义。

[1]张树文，苏晓红，潘丽.基层适宜的淋病奈瑟菌检验技术.中国计划生育志，2013，21（7）:502

[2]徐新蓉，马萍，龚国富.不同症状淋病奈瑟菌感染患者实验室检测方法选择与比较.国际检验医学杂志，2012，33（21）:2637

[3]顾伟鸣，杨阳，吴磊，等．实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测泌尿生殖道沙眼衣原体感染.临床检验杂志，2010，28（4）：271

[4]高志华，金印，陈峰.实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中淋病奈瑟菌的分析.国际检验医学杂志，2012，33（4）:463 [5]杨丙莲.不同方法检测淋球菌的临床应用探讨.中外医疗，2013，36：172

[6]Raherison S，Clerc M，Trombert S，et al.Real-time high resolution melting PCR for identification of the Swedish variant of Chlamydia trachomatis.JM icrobiol Methods，2009，78（1）:101